人FL的甲醇酵母表達及腺病毒介導的免疫基因治療.pdf

1、人FL(flt3 ligand)是近年發(fā)現(xiàn)的重要造血細胞因子，其功能類似于hSCF，主要作 用于早期原始的干／祖細胞，促進其增殖和分化，與其它細胞因子聯(lián)合應用，可產(chǎn)生明顯的協(xié)同作用。與hSCF不同的是，hFL對肥大細胞沒有作用，沒有種屬特異性，并且可顯著刺激樹突狀細胞(DC)和自然殺傷細胞(NK)的增殖。這些功能使FL在造血系統(tǒng)原發(fā)性或繼發(fā)性損傷疾病的治療、造血干細胞移植，特別是在腫瘤免疫基因治療和免疫瘴苗制備等方面具有重要的潛在

2、應用價值。DCs細胞作為功能最強的抗 原提呈細胞(APC)，在免疫應答反應中起著關鍵作用，能誘導非特異性先天免疫反應和特異性獲得免疫反應。利用FL擴增DCs的抗腫瘤免疫治療效果，在動物模型中已得到驗證。本研究利用hFL能顯著刺激體內(nèi)DCs增殖的生物學特性，用基因工程方法表達重組hFL，對小鼠種植瘤進行抑瘤效果試驗，為進一步研究hFL在腫瘤免疫治療中的有效作用提供實驗依據(jù)。本論文主要包括兩部分內(nèi)容： 一、應用酵母表達系統(tǒng)，表

3、達分泌性人FL(hFL)的K84E／Q122R突變體。hFL第84位和122位氨基酸的密碼子分別改造為E和R的密碼子，并在N端采用甲醇酵母偏愛密碼子，以提高hFL的活性和表達量。將該突變體的基因克隆入酵母穿梭質(zhì)粒，得到重組表達載體pPIC9K-hFL，電轉(zhuǎn)入甲醇酵母，用原位雙膜篩選法篩選獲得Mut<'+>及Mut<'s>高表達轉(zhuǎn)化子，分別進行了表達條件的優(yōu)選并基本建立了分離純化rhFL的工藝，兩者最佳表達條件為：Mut<'+>轉(zhuǎn)化子用B

4、MMY培養(yǎng)基(pH6.0)，Mut<'s>轉(zhuǎn)化子用BMMP(pH6.0)，經(jīng)2％甲醇誘導96h。與Mut<'+>型相比，Mut<'s>轉(zhuǎn)化子在含營養(yǎng)和色素較少的BMM培養(yǎng)基中即有高表達，且表達產(chǎn)物雜蛋白少，易于純化。重組hFL表達量達30mg／L。采用Q-FF分離→濃縮→Sephacryl S-200分離純化，步驟簡單有效。回收率約為20mg／L。用內(nèi)糖苷酶EndoH切除hFL N-糖鏈后，結果顯示hFL中除N-糖基化外，可能還有其他形

5、式的糖基化。純化的hFL經(jīng)Western印跡和N端 前10個氨基酸序列分析驗證，結果與預期一致，質(zhì)譜法測定其分子量為20～22kD。 生物學活性實驗結果表明，單用hFL可以顯著刺激小鼠骨髓有核細胞擴增，與mGM-CSF聯(lián)用可以協(xié)同增強刺激小鼠骨髓GM-CFU集落形成。 rhFL對鼠EL4淋巴瘤的抗腫瘤結果表明：小鼠皮下移植EL4淋巴瘤，連續(xù)注射14天hFL后，腫瘤比對照組減小，抑瘤率為25％左右。P<0.001，差別

6、具有顯著統(tǒng)計學意義。 二，應用腺病毒介導hFL與hGM-CSF進行抗腫瘤免疫基因治療。 應用AdEasy系統(tǒng)，構建和包裝了高表達hFL與hGM-CSF雙基因的重組腺病毒Ad-hFL-hGM-CSF。感染293細胞，培養(yǎng)上清中hFL24n表達量可達96ng／ml，hGM-CSF24h表達量可達306ng/ml。體外生物學實驗證明，表達的hFL對小鼠骨髓有核細胞有明顯增殖作用，且呈劑效關系；表達的hGM-CSF對TF1

7、有明顯的刺激增殖作用，與對照品的增殖作用相似，小鼠體內(nèi)注射一次5×10<'9>pfu重組腺病毒．Ad-hFL-hGM-CSF，血清中hFL24h表達量可達25ng/ml，hGM-CSF 8h表達量可達3．3ng/ml。注射8天后，脾臟重量明顯增加，細胞數(shù)增多，DC數(shù)目顯著增加，為正常值的～50倍。在鼠皮下移植EIA淋巴瘤模型的治療實驗中，注射四次．Ad-hFL-hGM-CSF，5×10<'9> pfu／次，腫瘤比對照組減小，抑瘤率為30

8、％，P值小于0．05，差別具有統(tǒng)計學意義。說明重組腺病毒Ad-hFL-hGM-CSF對小鼠皮下移植EL4淋巴瘤具有明顯的抑制作用。創(chuàng)新點：我們改造了hFL編碼序列中2個氨基酸的密碼子，并在N端采用甲醇酵母偏愛密碼子，以提高hFL的活性和表達量；聯(lián)合應用腺病毒介導的人FL和人GM-CSF，在體內(nèi)擴增DC的數(shù)量以抑制腫瘤生長，并且，經(jīng)我們改造過的腺病毒穿梭質(zhì)粒使hFL和hGM-CSF兩個目的基因在同一個表達載體中均獲得高效表達，這迄今尚未見