動(dòng)態(tài)觀測(cè)應(yīng)用血清腫瘤標(biāo)志物及熒光素酶構(gòu)建的前列腺癌仿生化模型的相關(guān)研究.pdf

1、報(bào)告指出，美國(guó)2010年有191533例前列腺癌新發(fā)病例和26329例死亡病例，超過(guò)肺癌，居男性腫瘤之首。近年來(lái)，我國(guó)前列腺癌的發(fā)病率明顯上升，伴隨著人口老齡化，環(huán)境變化，體檢意識(shí)的增強(qiáng)等原因，我國(guó)前列腺癌患者必將進(jìn)一步增加。我國(guó)前列腺癌患者必將進(jìn)一步增加，成為威脅老年男性第一殺手。雖然手術(shù)治療能有效地控制早期局限性前列腺癌，但是許多患者沒(méi)能重視，很少?gòu)?fù)查，最終導(dǎo)致復(fù)發(fā)。盡管臨床上常用ADT(ADT)作為晚期前列腺癌的姑息性治療方式。然

2、而，ADT只能延緩腫瘤的進(jìn)展，最終，多數(shù)患者不可避免的會(huì)發(fā)展到激素非依賴性前列腺癌，而對(duì)多種內(nèi)分泌藥物產(chǎn)生耐藥甚至抵抗而繼續(xù)進(jìn)展，侵犯周?chē)M織及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，繼而引起患者的死亡。此外，由于前列腺癌患者年齡大，基礎(chǔ)疾病較多，往往因?yàn)槠渌嚓P(guān)疾病引起相應(yīng)癥狀而不具備充分的身體素質(zhì)去耐受細(xì)胞毒性藥物及化療藥物所帶來(lái)的副作用。因此，迫切需要深入探討進(jìn)展性前列腺癌的發(fā)展及轉(zhuǎn)移機(jī)制，并評(píng)估新的治療手段對(duì)腫瘤免疫方面的效應(yīng)機(jī)制。
　　 動(dòng)物模型是

3、進(jìn)一步研究前列腺癌的發(fā)展、轉(zhuǎn)移機(jī)制、腫瘤與宿主免疫效能、評(píng)估腫瘤治療措施有效性的重要工具。目前，國(guó)內(nèi)外關(guān)于前列腺癌動(dòng)物模型的研究甚多，但是這些模型仍不能準(zhǔn)確模擬人類(lèi)前列腺癌發(fā)生、發(fā)展、侵襲及轉(zhuǎn)移的全過(guò)程，存在主要問(wèn)題是:1）對(duì)腫瘤發(fā)生發(fā)展相關(guān)的分子生物學(xué)事件尚未闡明;2）缺乏研究腫瘤與宿主相互作用的工具;3）反映人腫瘤分子生物學(xué)多樣性的模型不足。國(guó)內(nèi)外關(guān)于結(jié)合腫瘤血清標(biāo)志物等多途徑的觀察腫瘤生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移情況的研究尚少，且實(shí)驗(yàn)小鼠通常是重度

4、免疫功能缺陷的SCID小鼠或者裸鼠，無(wú)法分析腫瘤免疫學(xué)相關(guān)指標(biāo)。
　　 因此，本研究適時(shí)地利用了基因工程相關(guān)技術(shù)，結(jié)合血清腫瘤標(biāo)志物及報(bào)告基因系統(tǒng)，構(gòu)建出一個(gè)免疫功能健全的前列腺癌小鼠皮下種植模型，通過(guò)對(duì)其活體的觀察及檢測(cè)外周血腫瘤標(biāo)志物的變化情況，評(píng)估腫瘤生長(zhǎng)的過(guò)程，并利用流式細(xì)胞學(xué)技術(shù)探究模型的免疫相關(guān)指標(biāo)的變化情況，為前列腺癌免疫機(jī)制的研究和免疫耐受機(jī)制的研究提供了很好的工具。
　　 目的:結(jié)合熒光實(shí)時(shí)成像和血清學(xué)

5、腫瘤標(biāo)記技術(shù)，構(gòu)建一個(gè)可供評(píng)價(jià)免疫機(jī)制及生物學(xué)功能的小鼠前列腺癌動(dòng)物模型。
　　 方法:質(zhì)粒構(gòu)建:根據(jù)GenBank中表達(dá)人PSA蛋白的KLK3基因序列(GI:22208990)、Luc基因(GI:13195703)設(shè)計(jì)聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)引物，由上海英濰捷基有限公司合成。通過(guò)RT-PCR、PCR擴(kuò)增及酶切連接技術(shù)，分別擴(kuò)增出KLK3基因序列及l(fā)uc基因序列，并以pIRES元件為模板載體，分別將擴(kuò)增出luc及KLK3基因連接于

6、pIRES的上游和下游，酶切位點(diǎn)分別為XhoⅠ、MluⅠ和XbaⅠ、SalⅠ，與相應(yīng)酶切的pIRES-KLK3質(zhì)粒連接，構(gòu)建出Luc-pIRES-KLK3質(zhì)粒，質(zhì)粒提取后PCR驗(yàn)證無(wú)誤，并送公司測(cè)序鑒定（北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司）。
　　 質(zhì)粒穩(wěn)定轉(zhuǎn)染和鑒定:Luc-pIRES-KLK3質(zhì)粒測(cè)序正確后擴(kuò)大培養(yǎng)，lipo2000穩(wěn)定轉(zhuǎn)染小鼠前列腺癌細(xì)胞株RM-1，采用G418單克隆篩選法得到穩(wěn)定表達(dá)的單克隆株RM1-luc-p

7、IRES-KLK3。大量克隆培養(yǎng)該細(xì)胞株，用200ug/ml的G418壓力培養(yǎng)基維持一個(gè)月穩(wěn)定培養(yǎng)。
　　 熒光定量PCR(qRT-PCR)及Western blot鑒定PSA蛋白的表達(dá):qRT-PCR:提取總RNA，電泳驗(yàn)證其完整性，逆轉(zhuǎn)錄完成定量PCR，繪制熔解曲線及擴(kuò)增曲線，并設(shè)置對(duì)照組，進(jìn)行相對(duì)表達(dá)量的對(duì)比;Western blot:標(biāo)準(zhǔn)的Bradford法進(jìn)行蛋白定量，SDS-PAGE凝膠電泳，分離后的蛋白被轉(zhuǎn)移到PV

8、DF膜上，室溫封閉1小時(shí)，一抗為抗PSA單克隆抗體(santa crus，1∶1000)，4度孵育過(guò)夜，HRP標(biāo)記的兔抗鼠IgG作為二抗(santa crus，1∶1000)室溫封閉1小時(shí)后，加入ECL化學(xué)發(fā)光試劑置于暗盒中用X片膠片曝光檢測(cè)。
　　 體外發(fā)光強(qiáng)度檢測(cè):取96孔板一塊，分為8組，每組7個(gè)孔，吸取混合均勻的RM1-luc-pIRES-KLK3細(xì)胞2×105個(gè)，倍比稀釋?zhuān)總€(gè)孔的細(xì)胞數(shù)減半到第6孔，最后1孔中僅加入R

9、M-1細(xì)胞作為空白對(duì)照，除單加細(xì)胞的孔，其他孔內(nèi)于熒光顯像前10分鐘加入熒光素酶底物luciferin100ul，終濃度為150μg/mL。靜置3 min，然后在IVIS100成像系統(tǒng)上檢測(cè)發(fā)光情況并拍照記錄。
　　 動(dòng)物模型的構(gòu)建:小鼠腫瘤體積大小觀察測(cè)定及活體熒光成像:取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期RM1-luc-IRES-KLK3細(xì)胞，DPBS制成密度為2.0×106個(gè)/ml細(xì)胞懸液，加入到5mg/ml的基底膜基質(zhì)中，混勻備用。C57BL/

10、6小鼠均飼養(yǎng)在層流架中，SPF級(jí)別，采用10％水合氯醛合劑按300 mg/kg劑量腹腔注射麻醉，于小鼠背側(cè)部皮下注射100ul，約2×105個(gè)細(xì)胞。分別于注射后第1周、第2周、4周、8周時(shí)觀察小鼠皮下腫瘤生長(zhǎng)情況，并游標(biāo)卡尺記錄腫瘤體積大小情況，同時(shí)通過(guò)IVIS100小動(dòng)物活體成像系統(tǒng)實(shí)時(shí)觀測(cè)小鼠活體熒光強(qiáng)度及有無(wú)微轉(zhuǎn)移灶等情況，顯像前15分鐘按150 mg/kg腹腔注射熒光素底物D-luciferin(PerbioScience Ne

11、derland)。
　　 小鼠外周血PSA測(cè)定及外周血免疫學(xué)分析:PSA測(cè)定采用取眼內(nèi)眥血法分別取得每只小鼠約0.2ml全血離心后得到約0.1ml血漿將標(biāo)本置于儀器Achitect i2000中用Total PSA檢測(cè)試劑對(duì)其進(jìn)行定量分析;另于第7天和第21天的時(shí)候，取小鼠眼內(nèi)眥血液樣品分析小鼠外周血中MDSC細(xì)胞(CD11b+、GR-1+)及T調(diào)節(jié)細(xì)胞(CD4+、Foxp3+)，隨腫瘤生長(zhǎng)進(jìn)展的變化情況。
　　 記錄小

12、鼠存活時(shí)間，于第8周對(duì)所有小鼠安樂(lè)死，取皮下腫瘤及肝臟、腦、肺等組織進(jìn)行HE染色、免疫組化檢查。
　　 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析:全部數(shù)據(jù)經(jīng)統(tǒng)計(jì)軟件SPSS13.0處理，計(jì)量資料以陽(yáng)性率表示，計(jì)數(shù)資料比較選用Pearson卡方檢驗(yàn)，生存分析采用Kaplan-Meier法，兩組之間的均數(shù)比較采用未配對(duì)t檢驗(yàn)，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，p＜0.01表示差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)果:成功構(gòu)建出Luc-pIRES-KLK3質(zhì)粒，

13、酶切電泳鑒定分析無(wú)誤，測(cè)序公司測(cè)序驗(yàn)證KLK3及l(fā)uc基因的插入。
　　 穩(wěn)定細(xì)胞株構(gòu)建及鑒定:利用G418單克隆篩選法成功篩選出RM1-luc-pIRES-KLK3單克隆細(xì)胞株，并用qRT-PCR的方法從基因水平上鑒定該細(xì)胞特有的PSA的表達(dá)，繼而Western blot蛋白水平上檢測(cè)出PSA蛋白的表達(dá)體外熒光成像檢測(cè):通過(guò)IVIS100成像系統(tǒng)觀察該細(xì)胞系，確定存在熒光素酶的表達(dá)，且表達(dá)水平的高低與細(xì)胞數(shù)量呈正相關(guān)。

14、　　 小鼠荷瘤模型:皮下接種2×105個(gè)RM1-luc-pIRES-KLK3細(xì)胞數(shù)，1周后所有小鼠100％可見(jiàn)成瘤，并穩(wěn)定表達(dá)PSA。在細(xì)胞接種后的第1、2、4、8周分別檢測(cè)外周血血清中PSA水平及IVIS動(dòng)態(tài)成像系統(tǒng)中熒光定量分析，結(jié)合游標(biāo)卡尺測(cè)量小鼠皮下腫瘤的體積大小情況，結(jié)果表明小鼠活體腫瘤的熒光強(qiáng)度和腫瘤體積大小呈正相關(guān)(R2=0.937)，同樣的結(jié)果也出現(xiàn)在小鼠活體腫瘤的熒光強(qiáng)度與PSA水平之間(R2=0.988)，同時(shí)分析

15、表明，腫瘤體積大小與PSA水平呈正相關(guān)(R2=0.908)。外周血流式細(xì)胞學(xué)分析結(jié)果表明，隨著腫瘤生長(zhǎng)，MDSC細(xì)胞和Treg細(xì)胞數(shù)量出現(xiàn)了相應(yīng)變化，表達(dá)CD4+、Foxp3+免疫細(xì)胞Treg所占淋巴細(xì)胞百分比(7.35％ vs.9.62％; p=0.0001)呈上升的趨勢(shì)，表達(dá)CD11b+、Gr-1+的MDSC細(xì)胞同樣也在增長(zhǎng)(1.93％ to3.02％，p=0.002)。最終HE染色確認(rèn)了小鼠皮下腫塊為前列腺癌并相關(guān)轉(zhuǎn)移瘤。