犬臍血間質(zhì)干細(xì)胞肌源性誘導(dǎo)及梗塞心肌移植后影響心功能機(jī)制的研究.pdf

1、目的： 研究犬臍血間質(zhì)干細(xì)胞肌源性誘導(dǎo)后生理性質(zhì)的變化以及移植后對心臟功能影響機(jī)制。 方法： 選取孕齡50天左右的妊娠犬，取臍帶血，密度梯度離心法分離單個(gè)核細(xì)胞，應(yīng)用DMEM液培養(yǎng)擴(kuò)增干細(xì)胞，免疫組化法檢測細(xì)胞表面抗原CD34、CD11a、CD11b、CD29、CD71的表達(dá)，確認(rèn)間質(zhì)干細(xì)胞。選取第四代的間質(zhì)干細(xì)胞，經(jīng)5-aza、心肌裂解液和心肌誘導(dǎo)液三種方法肌源性誘導(dǎo)分化，檢測Nkx2.5基因的表達(dá)，免疫組化染

2、色檢測a-actin、desmin、β-MHC、troponin-Ⅰ的陽性率；膜片鉗全細(xì)胞模式檢測4組細(xì)胞的動(dòng)作電位發(fā)放情況，比較外向鉀電流的差異；confocal檢測細(xì)胞內(nèi)Ca2+的濃度變化和KCL對胞內(nèi)Ca2+濃度的影響。rAAV1/2-LacZ轉(zhuǎn)染間質(zhì)干細(xì)胞，采用X-gal化學(xué)染色法檢測標(biāo)記基因產(chǎn)物β-gal。成年犬36條，隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組與對照組。結(jié)扎冠狀動(dòng)脈左前降支建立急性心肌梗塞動(dòng)物模型。實(shí)驗(yàn)組經(jīng)冠狀動(dòng)脈左前降支將5-aza誘

3、導(dǎo)的間質(zhì)干細(xì)胞注射移植入梗塞區(qū)域，對照組僅經(jīng)冠狀動(dòng)脈左前降支注射等量的DMEM培養(yǎng)液。分別于術(shù)后2、4、8周在DSA下行左心室造影測定心功能，然后處死動(dòng)物，取心肌組織免疫熒光法檢測移植細(xì)胞β-gal和細(xì)胞間連接蛋白表達(dá)，以觀察移植間質(zhì)干細(xì)胞的存活、心肌再生和細(xì)胞間連接的形成。TUNEL法檢測殘存心肌細(xì)胞的凋亡，免疫組化染色法測定梗塞區(qū)域心肌細(xì)胞Bcl-2和Bax蛋白的表達(dá)，探討干細(xì)胞移植對心肌細(xì)胞凋亡的影響；檢測殘存心肌體積和心肌膠原網(wǎng)

4、沉積，探討干細(xì)胞移植對殘存心肌的影響。應(yīng)用Image-ProPlus5.1軟件進(jìn)行圖像分析，計(jì)算光密度(density)值和累積光密度(IOD)值。數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±sd)表示，3組間比較采用單因素方差分析(ANOVA)和卡方檢驗(yàn)，P＜0.05認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性差異。SPSS11.5統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。 結(jié)果： 所培養(yǎng)的細(xì)胞呈現(xiàn)長梭形，表面抗原表達(dá)為：CD11a(-)、CD11b(-)、CD34(-)、C

5、D29(+)、CD71(+)，提示為臍血間質(zhì)干細(xì)胞。3種誘導(dǎo)方法均可誘導(dǎo)Nkx2.5的表達(dá)，細(xì)胞裂解液組表達(dá)量最高。MSCs在分化前不表達(dá)心肌結(jié)構(gòu)蛋白，誘導(dǎo)后可表達(dá)α-actin、desmin、β-MHC和Troponin-I，四種蛋白在不同的分化條件下表達(dá)的陽性率不同；MSCs和細(xì)胞誘導(dǎo)液組未見明顯動(dòng)作電位產(chǎn)生，心肌裂解液組和5-aza組可產(chǎn)生動(dòng)作電位；受誘導(dǎo)方法影響，4種細(xì)胞的鉀電流、細(xì)胞內(nèi)Ca2+的濃度和KCL對胞內(nèi)Ca2+濃度的

6、影響也有所變化。rAAV1/2-LacZ可高效轉(zhuǎn)染臍血間質(zhì)干細(xì)胞，并能長期表達(dá)標(biāo)記基因LacZ的產(chǎn)物β-gal。5-aza誘導(dǎo)后并經(jīng)LacZ報(bào)告基因標(biāo)記的間質(zhì)干細(xì)胞經(jīng)冠狀動(dòng)脈移植入急性心梗心臟的梗塞區(qū)域，移植的細(xì)胞在梗塞周邊區(qū)存活并與殘存心肌通過connexin-43和cadherin形成細(xì)胞間連接。術(shù)后2、4、8周左心室造影測定心功能顯示：實(shí)驗(yàn)組的EF值明顯高于對照組，而INEDVI明顯低于對照組。實(shí)驗(yàn)組的心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)低于對照組，

7、Bcl-2蛋白表達(dá)量明顯高于對照組，而Bax蛋白表達(dá)量低于對照組。實(shí)驗(yàn)組殘存心肌體積高于對照組，膠原網(wǎng)排列有序。 結(jié)論： 1、臍血間質(zhì)干細(xì)胞可被誘導(dǎo)為肌源性細(xì)胞；三種誘導(dǎo)方法對心肌結(jié)構(gòu)蛋白、電生理和胞內(nèi)Ca2+濃度調(diào)控系統(tǒng)的分化程度不一樣，單一的誘導(dǎo)方法尚難以在體外誘導(dǎo)出成熟的心肌細(xì)胞，綜合考慮三方面性質(zhì)，5-aza誘導(dǎo)的心肌樣細(xì)胞與心肌細(xì)胞最為接近。 2、臍血間質(zhì)干細(xì)胞肌源性誘導(dǎo)后移植可以： a、心肌再

8、生。體外誘導(dǎo)后的間質(zhì)干細(xì)胞具有肌源性細(xì)胞的初步性質(zhì)，進(jìn)入心肌微環(huán)境后進(jìn)一步分化成熟，形成閏盤結(jié)構(gòu)，與宿主心肌形成細(xì)胞間連接； b、通過上調(diào)Bcl-2、減少Bax的表達(dá)而拮抗心肌凋亡，減少心梗后心肌細(xì)胞的進(jìn)一步丟失； c、短期內(nèi)促進(jìn)殘存心肌肥大，增加心肌收縮力； d、降低或防止心肌梗塞區(qū)域內(nèi)膠原纖維的沉積和融合，使心肌膠原網(wǎng)有序排列，從而降低心室舒張僵硬度，改善心室重構(gòu)。 3、臍血間質(zhì)干細(xì)胞梗塞心肌移植后可