骨髓及其動員干細(xì)胞改善梗塞心肌功能的旁分泌機制研究.pdf

1、本文就骨髓及其動員干細(xì)胞改善梗塞心肌功能的旁分泌機制進行了研究，主要從以下幾部分展開： 第一部分： HIF-1α介導(dǎo)的骨髓干細(xì)胞高表達(dá)VEGF和iNOS對心肌細(xì)胞保護的體外研究目的：探討B(tài)MSCs是否通過HIF-1α信號通路誘導(dǎo)VEGF和iNOS的高表達(dá)，在低氧環(huán)境中保護心肌細(xì)胞抵抗凋亡。方法：從GFP轉(zhuǎn)基因小鼠分離培養(yǎng)BMSCs。采用體外BMSCs和心肌細(xì)胞低氧共培養(yǎng)(1％O2)或H2O2(200μmol)處理模擬體內(nèi)

2、心肌梗塞氧應(yīng)激損傷。以LDH釋放、MTT攝取、DNA斷裂、膜聯(lián)蛋白V陽性細(xì)胞做為細(xì)胞損傷指標(biāo)。ELISA測定BMSCs總HIF-1α、活性HIF-1α蛋白表達(dá)及VEGF的釋放。實時定量PCR測定BMSCs中HIF-1α、VEGF和iNOS的基因表達(dá)。熒光免疫細(xì)胞化學(xué)觀察HIF-1α蛋白定位。結(jié)果：心肌細(xì)胞低氧暴露30小時，LDH釋放增加，MTT攝取降低，該現(xiàn)象可因與BMSCs的共培養(yǎng)得到糾正；同時低氧或H2O2處理所致的心肌細(xì)胞凋亡也隨

3、之減少。在低氧條件下BMSCs中總HIF-1α蛋白及其激活型蛋白的表達(dá)增加，并易位至細(xì)胞核及核周區(qū)域，同時伴隨VEGF和iNOS的表達(dá)增加。HIF-1α蛋白的增加及易位可被HIF-1α抑制劑2-ME2(5μmol)抑制。而且，VEGF和iNOS的分泌以及BMSCs對心肌細(xì)胞的保護作用均可被HIF-1α抑制劑2-ME2或HIF-1α中和抗體(200ng/ml～3200ng/ml)所抑制。另外，外源性給予VEGF(12.5ng/ml～100

4、ng/ml)可復(fù)制對心肌細(xì)胞的保護作用，并呈劑量依賴性。BMSCs對心肌細(xì)胞的保護作用也可被選擇性iNOS抑制劑1400W(10mg/L)和非選擇性NOS抑制劑L-NAME(200μmol/L)所抑制。不過，未發(fā)現(xiàn)NO供體SNAP(300μmol/L)與BMSCs在對心肌細(xì)胞的保護作用上有協(xié)同作用。結(jié)論：BMSCs通過激活HIF-1α信號通路誘導(dǎo)保護性因子VEGF和iNOS的高表達(dá)，從而在低氧環(huán)境中保護心肌細(xì)胞抵抗凋亡。 第二部

5、分骨髓干細(xì)胞條件培養(yǎng)基改善心肌梗塞大鼠心功能的體內(nèi)研究 目的：以大鼠急性心肌梗塞動物模型為基礎(chǔ)，體內(nèi)移植BMSCs條件培養(yǎng)基，探討B(tài)MSCs改善缺血心肌功能的旁分泌機制。方法：LAD結(jié)扎后大鼠隨機分為5組，在缺血區(qū)周圍分5點即刻心肌內(nèi)分別注射60μl①生理鹽水(Ns)；②濃縮培養(yǎng)基對照(cM)；③濃縮BMSCs正常氧培養(yǎng)基(BMSCs-cNM)；④濃縮BMSCs低氧培養(yǎng)基(BMSCs-cHM)；⑤含1.5×106BMSCs的生理

6、鹽水(BMscs)。超聲心電圖觀察心功能、三色染色分析心臟梗塞面積、TUNEL染色分析凋亡細(xì)胞、免疫組化觀察血管形成。結(jié)果：與其它各組比較，BMSCs-cHM可有效改善缺血心肌功能，減少心肌梗塞面積，減少凋亡細(xì)胞，促進血管形成。結(jié)論：BMSCs通過分泌細(xì)胞保護性因子抵抗細(xì)胞凋亡，減少心肌細(xì)胞損失，減少梗塞面積，改善心肌功能。BMSCs通過旁分泌效應(yīng)間接促進血管發(fā)生可能為心肌修復(fù)的另一機制。 第三部分骨髓動員干細(xì)胞改善缺血心肌功能

7、與GATA4的相關(guān)性研究 目的：探討經(jīng)心肌梗塞激活的MPCs是否通過高表達(dá)GATA4，從而更有利于參與心肌修復(fù)。方法：MPCs分離自經(jīng)LAD結(jié)扎的GFP轉(zhuǎn)基因小鼠心臟血。野生型小鼠經(jīng)LAD結(jié)扎后隨機分為三組，心肌內(nèi)植入MPCs、BMSCs或DMEM做為對照。心臟超聲測定心功能，三色染色法檢測梗塞面積。FCM分析MPCs和BMSCs細(xì)胞表型。常規(guī)PCR或?qū)崟r定量PCR做基因表達(dá)分析。ELISA測定血清G-CSF分泌?；蛐酒治鲛D(zhuǎn)

8、染了GATA4的BMSCs的基因譜。免疫熒光檢測細(xì)胞的轉(zhuǎn)分化。結(jié)果：缺血心肌G-CSF表達(dá)增加，血清G-CSF增加與循環(huán)血MPCs的增加呈正相關(guān)。MPCs與BMSCs細(xì)胞表面標(biāo)記相似，但MPCs高表達(dá)GATA4。轉(zhuǎn)染了GATA4的BMSCs的基因譜顯示GATA4上調(diào)一系列心血管發(fā)育相關(guān)基因、生長因子及抗凋亡蛋白Bcl-2。MPCs移植明顯改善心功能，減少梗塞面積。更為重要的是，體外實驗顯示相對于BMSCs，MPCs更有效的保護心肌細(xì)胞抵