骨髓間充質干細胞移植對擴張型心肌病心衰大鼠心功能改善作用機制的研究.pdf

1、前言
　　由冠心病、心肌病等各種疾病所致的心肌損傷，其最終結果都將導致有功能的心肌細胞大量喪失。成年人類的心肌細胞不能通過自身細胞再生修復，只能形成纖維化瘢痕，逐步發(fā)生心室重塑，最終導致心力衰竭。隨著分子生物學的發(fā)展和對干細胞的深入研究，應用骨髓間充質干細胞(BMMSCs)進行心肌細胞成形術治療心力衰竭成為目前各國學者研究的熱點。
　　大量動物實驗和臨床觀察已證實，骨髓間充質干細胞移植能夠促進心肌梗死所致心力衰竭的心功能恢復

2、，但是對于非缺血性心肌病導致的心力衰竭，移植后的效果尚缺乏足夠的動物實驗及臨床實驗依據(jù)，并且對其機制研究尚少。
　　本實驗通過體外培養(yǎng)及誘導大鼠骨髓間充質干細胞，與體外培養(yǎng)的心肌細胞進行超微結構、組織化學與分子生物學比較，研究其誘導后特性。應用阿霉素注射法建立心肌病心衰大鼠模型，成功后心肌內移植標記后的骨髓間充質干細胞，觀察其對心功能的影響，并探討其作用機制。
　　實驗方法
　　1、探討體外培養(yǎng)的骨髓間充質干細胞誘導后

3、的生物學特性取雄性Wistar大鼠體外分離培養(yǎng)骨髓間充質干細胞，傳至一代后經(jīng)10μmol/L的5-氮胞苷體外誘導，免疫組化法觀察細胞蛋白表達的變化，電鏡下觀察細胞誘導前后超微結構的改變，RT-PCR檢測心肌特異性因子ANP、BNP、α-MHC、β-MHC的表達，并與體外培養(yǎng)的原代心肌細胞比較，觀察二者之間的生物學異同。
　　2、觀察同種異體大鼠骨髓間充質干細胞移植在阿霉素誘導的擴張型心肌病心衰大鼠心臟內存活和分化的情況及對心功能的

4、影響雌性Wistar大鼠55只，取正常組(n=10)，應用阿霉素注射法建立擴張型心肌病心衰大鼠模型(n=45)，隨機分成心衰對照組(n=15)，心衰+細胞移植治療A組(n=15)和心衰+細胞移植治療B組(n=15).將體外分離培養(yǎng)并誘導后的雄性大鼠骨髓間充質干細胞，用DAPI標記，A組移植誘導前的骨髓間充質干細胞，B組移植誘導后的骨髓間充質干細胞;4周后應用血流動力學方法檢測各組大鼠心功能情況，熒光法觀察移植細胞存活情況，免疫組化法觀察

5、細胞分化情況。
　　3、探討骨髓間充質干細胞心肌內移植對擴張型心肌病心衰大鼠心功能的保護機制應用阿霉素注射法建立擴張型心肌病心衰大鼠模型，成功后心肌內移植DAPI標記的骨髓間充質干細胞，分別于術后1w、2w、3w、4w進行血流動力學檢測，觀察移植后對大鼠心功能的影響，并于上述時間點取材，利用熒光法觀察移植細胞的存活情況，利用免疫組化分析心肌膠原纖維的沉積的改變、RT-PCR法觀察血管內皮生長因子(VEGF)及其受體flk-1、fl

6、t-1表達的改變。
　　實驗結果
　　1、成功進行了骨髓間充質干細胞和心肌細胞的體外分離培養(yǎng)和誘導鑒定，免疫組化法證實誘導后部分骨髓間充質干細胞α-橫紋肌肌動蛋白和心肌特異性蛋白肌鈣蛋白T染色表達陽性，證實已向心肌樣細胞分化;電鏡下胞漿內可見糖原顆粒，肌原纖維排列與原代培養(yǎng)的心肌細胞相似;RT-PCR證實誘導后的骨髓間充質干細胞表達心肌特異性因子ANP、BNP、α-MHC、β-MHC。
　　2、同種異體骨髓間充質干細胞

7、移植4周后移植仍可存活并部分分化成心肌細胞，表達心肌細胞特異性蛋白肌鈣蛋白T;與心衰對照組比較，細胞移植組心功能明顯改善，左室收縮壓(LVSP)較心衰對照組升高（122.5±10.2;121.6±11.3vs113.6±12.6）;左室舒張壓(LVDP)降低(17.1±6.1;18.4±5.5vs25.4±8.2);左室最大上升下降速率(±dp/dt)升高（3129.6±214.9;3044.2±295.4vs2378.9±351.1）

8、;(2344.9±114.5;2440.1±96.7vs1994.8±160.1)，p均＜0.05，且A組B組間無差異。
　　3、移植細胞在各個時間點均存活，并有部分細胞于術后4W表達心肌特異性蛋白肌鈣蛋白T;于術后2W開始，移植組心功能較對照組改善，左室收縮壓(LVSP)，左室內壓力最大上升及下降速率（±dp/dt）較對照組顯著升高，而左室舒張壓(LVDP)則顯著下降（P均＜0.05）。4w后心肌膠原纖維沉積減少（6.23±0.

9、68vs2.38±0.49，P＜0.01）;VEGF、flt-1、flk-1表達較同期對照組增加，分別于術后2w、3w達到高峰，以后逐漸減弱。
　　討論
　　1、細胞成形術是治療心力衰竭的合理途徑。BMMSCs由于自體來源，具備多向分化能力，可能是目前最有希望的供體細胞來源。研究證實，BMMSCs移植可改善心臟功能，其機制可能為移植的細胞分化為心肌細胞，參與宿主心臟收縮，改善心室功能。BMMSCs向心肌細胞分化的機制尚不明確

10、，在體外主要是化學誘導。本實驗用10μmol/L的5-氮胞苷體外誘導BMMSCs向心肌樣細胞分化。結果顯示誘導后部分細胞α-橫紋肌肌動蛋白與肌鈣蛋白T染色陽性，提示BMMSCs經(jīng)5-氮胞苷誘導后有了明確的心肌細胞化過程。電鏡結果顯示誘導后的BMMSCs，細胞內細胞器發(fā)達，可見糖原顆粒，有明顯的肌原纖維排列，與心肌細胞電鏡下的結構相似。RT-PCR結果顯示誘導后的BMMSCs表達肌原纖維的主要結構組成成份—α-MHC、β-MHC，表達心肌

11、特異性因子ANP、BNP，證實分化后的細胞已經(jīng)具備了心肌細胞的物質基礎和內分泌功能。
　　2、BMMSCs移植可以在心肌內存活并改善心肌梗塞后受損的心臟功能，但對因非缺血性心肌病導致的心力衰竭，細胞移植的效果尚缺乏足夠的依據(jù)。本研究將誘導前后的BMMSCs同種異體移植到心肌病心衰大鼠模型體內，結果顯示移植組的心功能恢復明顯優(yōu)于對照組，并且細胞誘導前后對心功能改善都有明顯的作用，二者之間無差異。BMMSCs改善心功能的作用機制可能涉

12、及多個方面，其中移植細胞在宿主心肌內存活并向心肌細胞分化是改善心功能的前提。本研究結果顯示，未誘導的BMMSCs移植進入心肌4周后仍能存活，并有部分細胞分化成心肌細胞，表達心肌特異性蛋白-肌鈣蛋白T。BMMSCs向心肌細胞分化的機制在體內主要是心肌微環(huán)境誘導。BMMSCs移植入心臟后，局部的心臟環(huán)境，各種因素包括心腔內壓力，心臟舒縮的牽拉作用以及電信號傳導刺激等，促發(fā)細胞間的連接并改變細胞外的基質構成，從而誘導其分化，即“組織環(huán)境學說”

13、。本研究觀察到體內外兩種方式均可使BMMSCs向心肌細胞分化，這可能即為移植誘導前后的BMMSCs對心功能改善無差異的原因。
　　3、本研究表明，細胞移植組大鼠的心功能有明顯的改善，此種改善作用在移植后3w開始體現(xiàn)，這可能與BMMSCs在宿主體內向心肌樣細胞分化，促進宿主細胞分泌促進血管生成的細胞因子及改善宿主心臟局部結構，提高局部心肌彈力所需的時間有關。本研究顯示移植組膠原纖維融合較少，排列有序，而對照組膠原纖維融合明顯，排列紊

14、亂，心肌組織的基本結構受到較大的破壞。這表明BMMSCs移植可在一定程度上防止膠原纖維的融合，保護心肌組織基本結構的有序排列。此外細胞移植改善心功能的機制可能還涉及血管生成增加。本研究證實，BMMSCs移植不但能夠上調肌體血管內皮生長因子VEGF的表達，還能夠上調VEGF受體Flt-1、Flk-1的表達，這種表達可能對持續(xù)促進缺血心肌的血管生成起到重要作用。VEGF與其受體的表達在時間上呈現(xiàn)不同步上調，可以持續(xù)穩(wěn)定的促進血管新生，促進缺

15、血心肌的功能恢復;而在后期，移植細胞引起的血管發(fā)生和心肌細胞再生有助于進一步改善心臟功能。
　　結論
　　1、骨髓間充質干細胞經(jīng)5-氮胞苷定向誘導后在超微結構和細胞因子的表達上類似于心肌細胞，已向心肌樣細胞分化。其電生理特性有待于進一步研究。
　　2、阿霉素注射法可成功建立擴張型心肌病心力衰竭大鼠模型，同種異體骨髓間充質干細胞移植4周后可存活并部分分化成心肌細胞，對擴張型心肌病心衰大鼠的心功能有保護作用，細胞誘導前后對