GATA-4基因?qū)Υ龠M骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞旁分泌作用的研究.pdf

1、目的:
　　從旁分泌作用機制上探討 GATA-4過表達(dá)對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Mesenchymal Stem Cells,MSCs)存活的影響。
　　方法:
　　1.用貼壁培養(yǎng)法分離純化Spraque-Dawley(SD)大鼠骨髓MSCs,并用流式細(xì)胞儀對其表面標(biāo)志進行鑒定。
　　2.用pMSCV逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)系統(tǒng)將GATA-4基因轉(zhuǎn)染MSCs(MSCGATA-4),并將空質(zhì)粒(MSCnull)作為對照。
　

2、　3.采用實時定量PCR(Real-time quantitative PCR,RT-PCR)、Western Blot和免疫組化方法分別檢測GATA-4的mRNA和蛋白質(zhì)在各組MSCs中的表達(dá)情況。
　　4.根據(jù)氧濃度及轉(zhuǎn)染質(zhì)粒情況,將培養(yǎng)的MSCs分成:常規(guī)氧組:MSCs、MSCNull和MSCGATA-4組;缺氧組:MSCs、MSCNull和MSCGATA-4組。
　　5.收集各組 MSCs的培養(yǎng)上清液,采用酶聯(lián)免疫吸

3、附試驗(Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)檢測各組 MSCs中的血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)、肝細(xì)胞生長因子(hepatocyte growth factor, HGF)和胰島素樣生長因子-1(insulin growth factor-1, IGF-1)。
　　6. MSCs培養(yǎng)48h后,用 MTT比色法檢測細(xì)胞

4、增殖,膜聯(lián)蛋白V染色法檢測細(xì)胞凋亡,乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase,LDH)釋放量檢測細(xì)胞損傷,來評價各組MSCs的存活情況。
　　7.加入VEGF和IGF-1中和抗體后再培養(yǎng)48h,再次使用上述相同方法評估各組MSCs的存活情況。
　　結(jié)果:
　　1.成功分離純化骨髓MSCs,細(xì)胞接種24h后開始貼壁,呈較大的橢圓形,48h后細(xì)胞貼壁逐漸增多,呈均勻一致的長梭狀,方向較規(guī)律,呈平行或旋渦狀生長

5、;
　　2.實時定量PCR、Western Blot和免疫組化方法結(jié)果顯示GATA-4的mRNA和蛋白質(zhì)在MSCGATA-4組中呈過量表達(dá)。
　　3.缺氧狀態(tài)下細(xì)胞比常規(guī)氧下細(xì)胞分泌 VEGF、 HGF和 IGF-1明顯增多(P<0.05);常規(guī)氧下,MSCGATA-4組VEGF和IGF-1的表達(dá)量明顯較MSCs和MSCnull組升高(P<0.05),而HGF表達(dá)量未見明顯差異(P>0.05);缺氧狀態(tài)下,MSCGATA-4

6、組的VEGF和IGF-1的表達(dá)量明顯較MSCs和MSCnull組升高(P<0.05),而HGF表達(dá)量未見明顯差異(P>0.05)。
　　4.與加入抗體之前相比,分別加入 VEGF和 IGF-1中和抗體后,各組細(xì)胞的MTT攝取率均降低,膜聯(lián)蛋白V陽性細(xì)胞率和LDH釋放量均升高(P<0.05);缺氧狀態(tài)下,加入中和抗體后,與MSCs和MSCnull組相比,MSCGATA-4 MTT攝取率較高,膜聯(lián)蛋白V陽性細(xì)胞率和LDH釋放量均較低(

7、P<0.05);缺氧MSCs與缺氧MSCnull組比較,存活情況差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。
　　結(jié)論:
　　1.通過基因轉(zhuǎn)染技術(shù)可以成功將骨髓MSCs高效過量表達(dá)GATA-4。
　　2.過表達(dá)GATA-4的骨髓MSCs可以促進其分泌VEGF、HGF和IGF-1。
　　3.加入VEGF和IGF-1中和抗體后MSCs存活明顯受抑制,而GATA-4過表達(dá)可以改善細(xì)胞存活,推測GATA-4通過干擾MSCs的旁分泌