脯氨酸羥化酶Ⅱ?qū)χ鹃g充質(zhì)干細(xì)胞旁分泌介導(dǎo)的心肌保護(hù)作用的影響及其機(jī)制研究.pdf

1、目的：觀察RNA干擾脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞脯氨酸羥化酶II(PHD2)對(duì)其旁分泌介導(dǎo)的心肌保護(hù)作用的影響及其機(jī)制。
　　方法：本實(shí)驗(yàn)原代提取人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞(adipose-derived mesenchymal stem cells, ADSCs)，并采用流式細(xì)胞術(shù)(flow cytometry, FCM)檢測(cè)表面分子進(jìn)行鑒定。包裝脯氨酸羥化酶II(PHD2) RNA干擾載體的慢病毒轉(zhuǎn)染ADSCs使其PHD2低表達(dá)。用H2O2(10

2、0μM)刺激新生大鼠心肌細(xì)胞(neonatal rat ventricular myocytes, NRVMs)6小時(shí)，建立心肌細(xì)胞氧化損傷模型。實(shí)驗(yàn)將NRVMs分為5組：正常對(duì)照組，H2O2氧化損傷模型組，ADSC-條件培養(yǎng)基（conditioned medium, CM）組，空載體-ADSC-CM組，PHD2干擾-ADSC-CM組，其中后四組均用H2O2處理。ADSC條件培養(yǎng)液(CM)預(yù)處理NRVMs，采用末端脫氧核苷?；D(zhuǎn)移酶介導(dǎo)

3、性dUTP切口末端標(biāo)記(TUNEL)染色和免疫印跡法檢測(cè)caspase-3蛋白表達(dá)觀察H2O2誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡。ELISA方法檢測(cè)ADSC-CM中的促存活細(xì)胞因子血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)、肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子-1(hepatocyte growth factor, HGF)、間質(zhì)細(xì)胞衍生因子1(stromal-derived factor1, SDF-1)、胰島素樣

4、生長(zhǎng)因子-1(insulin growth factor-1, IGF-1)和分泌型卷曲相關(guān)蛋白2(secreted frizzled-related protein2, sFRP2)。
　　結(jié)果：1.采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)ADSCs細(xì)胞表面分子，其中CD44，CD73，CD90，CD105表達(dá)均為陽(yáng)性，表達(dá)陽(yáng)性細(xì)胞比例分別為CD4496.07％，CD7399.81%，CD9099.22%， C10599.91%；CD34，CD45表

5、達(dá)陽(yáng)性細(xì)胞比例分別為0.96%和0.15%，表達(dá)幾乎為陰性。流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示細(xì)胞均一性較好，表型表達(dá)與既往研究報(bào)道結(jié)果一致，因此基本可以斷定本實(shí)驗(yàn)所分離、培養(yǎng)出的細(xì)胞主要為ADSCs，且純度較高。
　　2. ADSCs采用第3代，待融合度達(dá)50～60%，進(jìn)行空載體Lenti-GFP和Lenti-shPHD2-GFP慢病毒轉(zhuǎn)染，感染效率（綠色熒光陽(yáng)性率）達(dá)90%以上。
　　3.空載體-GFP和PHD2干擾慢病毒載體轉(zhuǎn)染A

6、DSCs成功后，免疫印跡法檢測(cè)ADSCs的PHD2的蛋白表達(dá)，PHD2干擾-ADSC組較空載體-GFP組降低約70%(P<0.05)。
　　4. H2O2處理導(dǎo)致心肌細(xì)胞明顯凋亡，TUNEL染色檢測(cè)細(xì)胞凋亡比率為（71.7±0.9）%。在ADSC-CM組、空載體-ADSC-CM組，其條件培養(yǎng)液預(yù)處理在一定程度上均減弱H2O2誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡，較H2O2氧化損傷模型組TUNEL陽(yáng)性率分別降低12.9%和16.9%。PHD2干擾-A

7、DSC-CM較空載體-ADSC-CM預(yù)處理明顯減少NRVM的凋亡，TUNEL陽(yáng)性率降低30.3%(P<0.05)。
　　5. H2O2處理導(dǎo)致心肌細(xì)胞明顯凋亡，caspase-3蛋白表達(dá)較對(duì)照組升高64.2%。在ADSC-CM組、空載體-ADSC-CM組，其條件培養(yǎng)液預(yù)處理在一定程度上均減弱 H2O2誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡，較H2O2氧化損傷模型組caspase-3蛋白表達(dá)分別降低16.5%和24.1%。PHD2干擾-ADSC-CM較

8、空載體-ADSC-CM預(yù)處理明顯減少NRVM的凋亡，caspase-3蛋白表達(dá)降低24.8%(P<0.05)。
　　6. PHD2干擾后ADSC-CM中細(xì)胞因子IGF-1和sFRP2明顯增加，分別為空載體-ADSC-CM的2.09倍（P<0.05）和1.76倍（P<0.05）。IGF-1中和抗體干預(yù)后，與PHD2干擾-ADSC-CM組相比，PHD2干擾-ADSC-CM-IGF-1抗體中和組TUNEL陽(yáng)性率明顯升高(P<0.05)；

9、sFRP2中和抗體干預(yù)后，與PHD2干擾-ADSC-CM組相比，PHD2干擾-ADSC-CM-IGF-1抗體中和組caspase-3蛋白表達(dá)明顯升高(P<0.05)。說(shuō)明IGF-1和sFRP2中和抗體干預(yù)后PHD2干擾-ADSC-CM的的抗心肌細(xì)胞凋亡作用明顯受抑制。
　　結(jié)論：1. ADSC通過(guò)旁分泌作用抑制超氧應(yīng)激誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷。2. PHD2干擾后增強(qiáng)了ADSC旁分泌介導(dǎo)的心肌保護(hù)作用，其機(jī)制可能為增加ADSC促存活細(xì)胞