犬臍血MSC異體移植和對(duì)心肌梗死作用的研究.pdf

1、目的：研究犬臍血間質(zhì)干細(xì)胞同種異體移植免疫耐受的可能性和相關(guān)的免疫學(xué)特征以及對(duì)心梗后心臟功能的影響. 方法：選取孕齡50天左右的妊娠犬,取臍帶血,密度梯度離心法分離單個(gè)核細(xì)胞,應(yīng)用IMDM液培養(yǎng)擴(kuò)增干細(xì)胞,免疫組化法檢測(cè)細(xì)胞表面抗原CD34、CDI 1a、CD11b、CD29、CD71的表達(dá),確認(rèn)間質(zhì)干細(xì)胞.選取第四代的間質(zhì)干細(xì)胞,免疫組化染色檢測(cè)其MHC-I和MHC-II的表達(dá),觀察5-aza誘導(dǎo)分化、IL-1β、INF-γ和

2、INF-α對(duì)其MHC-II表達(dá)有何影響.rAAV1/2-LacZ轉(zhuǎn)染間質(zhì)干細(xì)胞,采用X-gal化學(xué)染色法檢測(cè)標(biāo)記基因產(chǎn)物β-gal.成年犬36條,隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組.應(yīng)用結(jié)扎冠狀動(dòng)脈左前降支法建立急性心肌梗死動(dòng)物模型.實(shí)驗(yàn)組將異體的間質(zhì)干細(xì)胞經(jīng)冠狀動(dòng)脈注入梗塞區(qū)域,對(duì)照組僅注射等量IMDM培養(yǎng)液.分別于術(shù)后2、4、8周在DSA下行左心室造影測(cè)定心功能,然后處死動(dòng)物,取心肌組織免疫組化染色法檢測(cè)表達(dá)β-gal的細(xì)胞,以確定移植問質(zhì)干細(xì)

3、胞的存活和心肌再生.TUNEL法檢測(cè)梗塞區(qū)域心肌細(xì)胞的凋亡,免疫組化染色法測(cè)定梗塞區(qū)域心肌細(xì)胞Bcl-2和Bax蛋白的表達(dá),探討干細(xì)胞移植對(duì)心肌細(xì)胞凋亡的影響.免疫組化法測(cè)定梗塞區(qū)域浸潤的CD4+T、CD8+T,觀察間質(zhì)干細(xì)胞移植對(duì)T淋巴細(xì)胞分布的影響.應(yīng)用Image-Pro Plus 5.1.0.20軟件進(jìn)行圖像分析,計(jì)算光密度(density)值和累積光密度(IOD)值.數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示,組間比較采用單因素方差分析(

4、ANOVA)和t檢驗(yàn),P<0.05認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性差異.SPSS11.1統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理. 結(jié)果：培養(yǎng)的細(xì)胞呈現(xiàn)長梭形,表面抗原表達(dá)為:CDIla(-)、CDllb(-)、CD34(-)、CD29(+)、CD71(+),提示為間質(zhì)干細(xì)胞.rAAV1/2-LacZ可高效轉(zhuǎn)染臍血間質(zhì)干細(xì)胞,并能長期表達(dá)標(biāo)記基因LacZ的產(chǎn)物β-gal.檢測(cè)表明,臍血間質(zhì)干細(xì)胞為MHC-I(+)、MHC-II(-),培養(yǎng)液中加入炎癥因子IL-

5、1β、INFγY、以及INF-α培養(yǎng)72h后,臍血間質(zhì)干細(xì)胞仍為MHC-II(-).5-aza.誘導(dǎo)后并經(jīng)LacZ報(bào)告基因標(biāo)記的間質(zhì)干細(xì)胞經(jīng)冠狀動(dòng)脈移植入急性心梗心臟的梗塞區(qū)域,移植的細(xì)胞在梗塞周邊區(qū)存活并與殘存心肌形成緊密連接.術(shù)后2、4、8周左心室造影測(cè)定心功能顯示,實(shí)驗(yàn)組的EF值明顯高于對(duì)照組,而LVEDVI明顯低于對(duì)照組.實(shí)驗(yàn)組的心肌細(xì)胞凋亡的IOD值低于對(duì)照組,Bcl-2蛋白表達(dá)量明顯高于對(duì)照組,而Bax蛋白表達(dá)量低于對(duì)照組.

6、實(shí)驗(yàn)組CD4+的IOD值以及CD4+/CD8+的IOD比值明顯低于對(duì)照組,而CD8+T的IOD值顯著高于對(duì)照組. 結(jié)論：臍血間質(zhì)干細(xì)胞為MHC-Ⅱ(-)細(xì)胞,炎癥因子IL-1β、INF-α以及INF-γ不能誘導(dǎo)其表達(dá)MHC-Ⅱ分子,因而具有極低的免疫原性:同種異體的臍血間質(zhì)干細(xì)胞梗塞心肌移植后能長時(shí)間存活,其免疫抑制作用減少了局部CD4+T細(xì)胞的浸潤,維持CD4+/CD8+T在較低水平,表明宿主在一定程度上對(duì)移植的異體間質(zhì)干細(xì)胞