血管生成素-1基因修飾的骨髓間質(zhì)干細胞移植對大鼠心肌梗死心功能的影響.pdf

1、第一部分慢病毒介導(dǎo)Ang-1基因修飾的rMSCs的構(gòu)建及鑒定。 目的：構(gòu)建Ang-1基因修飾的rMSCs，為下一步轉(zhuǎn)基因干細胞(Ang-MSC)移植治療缺血性心臟病提供前期實驗基礎(chǔ)。 方法：制備感受態(tài)細菌，將慢病毒三質(zhì)粒分別進行轉(zhuǎn)化，采用QIAGENPlasmid kit進行質(zhì)粒抽提。在脂質(zhì)體介導(dǎo)下，慢病毒三質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HEK293T細胞包裝產(chǎn)生同時表達目的基因Ang和報告基因EGFP的慢病毒。提取、體外分離、培養(yǎng)、鑒定M

2、SC。將病毒上清濃縮后感染2-4代MSC，制備轉(zhuǎn)基因干細胞Ang-MSC，Western blotting檢測轉(zhuǎn)基因干細胞中Ang-1蛋白的表達情況。 結(jié)果：慢病毒三質(zhì)粒系統(tǒng)共轉(zhuǎn)染HEK293T細胞，熒光顯微鏡下可見HEK293T表達大量綠色熒光。濃縮病毒上清感染MSC后，熒光顯微鏡下觀察，pNL-MSC和Ang-MSC均可檢測到綠色熒光表達，Western blotting證實Ang-MSC成功表達Ang-1蛋白。 結(jié)

3、論：成功構(gòu)建Ang-1基因修飾的rMSCs，為下一步Ang-MSC移植治療缺血性心臟病做準備。 第二部分Ang-MSC基因工程干細胞移植對缺血性心臟病心功能改善的作用。 目的：Ang-MSC通過缺血心肌局部注射至大鼠心梗模型中，觀察其在缺血心肌中的分布情況，檢測目的基因的表達及血管新生密度，評價其對心功能的改善作用。 方法：采用國際公認的大鼠心梗模型制作方法。結(jié)扎冠狀動脈左前降支兩周后二次開胸，于心梗大鼠的缺血心

4、肌周圍分別注射MSC、Ang-MSC以及pNL-MSC。各組大鼠分別于細胞移植術(shù)后7d及28d行熒光顯微鏡觀察MSC移植后的分布情況，RT-PCR檢測各組心肌組織中Ang-1 mRNA的表達，VIII因子免疫熒光檢測血管新生情況，心臟彩超評定心功能的改善情況。 結(jié)果：Ang-MSC和pNL-MSC移植組心臟組織切片在熒光顯微鏡下均可見EGFP陽性細胞；Ang-MSC移植組心肌組織長期表達Ang-1 mRNA；與MSC和pNL-M