將體細(xì)胞誘導(dǎo)為胰島素分泌細(xì)胞的初步研究.pdf

1、糖尿病是影響人類健康的主要疾病之一，分為1型和2型兩類。1型糖尿病患者胰島β細(xì)胞胰島素分泌缺陷，需要終生依賴外源性胰島素，一些2型糖尿病患者在服用降糖藥物無法控制血糖的情況下也需要依賴于胰島素，對此，最根本的治療方法是進(jìn)行胰腺移植或胰島細(xì)胞移植，但胰島來源短缺及需要終生服用免疫抑制劑等問題限制了它的廣泛應(yīng)用。因此，尋找一種來源不受限制的人胰島細(xì)胞的替代物-即細(xì)胞替代治療，已成為近年來人們研究的焦點。在本實驗中，選取了人胚胎腎細(xì)胞系（29

2、3T）和人胚胎成纖維細(xì)胞（hEFs）為靶細(xì)胞來誘導(dǎo)胰島素的分泌。 目的：利用基因工程的方法，將胰腺β細(xì)胞發(fā)育過程中重要的轉(zhuǎn)錄因子導(dǎo)入293T和hEFs中表達(dá)，使細(xì)胞程序重編為胰島素分泌細(xì)胞，并探究程序重編過程中的分子機(jī)制。 方法：擴(kuò)增胰腺β細(xì)胞發(fā)育過程中三個重要的轉(zhuǎn)錄因子Pdx-1，Ngn3和Pax4的開放閱讀框，并連接到pAAV-MCS載體中。將構(gòu)建好的三個重組質(zhì)粒分別或兩兩組合或同時瞬時轉(zhuǎn)染到293T和hEFs細(xì)胞中

3、，恒溫箱培養(yǎng)48h后，從RNA水平和蛋白水平檢測293T和hEFs細(xì)胞是否有胰島素的分泌，并檢測細(xì)胞中胰島β細(xì)胞相關(guān)的基因的變化。 結(jié)果：單獨轉(zhuǎn)染Pdx-1重組質(zhì)?；騊dx-1與其他質(zhì)粒共轉(zhuǎn)到293T細(xì)胞中，48h后，細(xì)胞中出現(xiàn)了胰島素的分泌。選取胰島素分泌量最多的組合方式處理hEFs細(xì)胞，細(xì)胞中同樣出現(xiàn)了胰島素的分泌。RT-PCR結(jié)果還發(fā)現(xiàn)細(xì)胞中出現(xiàn)了原本沒有表達(dá)的胰腺相關(guān)基因Ngn3，beta2和pc2的表達(dá)，此外免疫熒光結(jié)