沉默PMR1表達(dá)促進(jìn)胰島細(xì)胞分泌胰島素的研究.pdf

1、近年來，全球糖尿?。╠iabetes mellitus）發(fā)病率增長迅速，糖尿病已經(jīng)成為繼腫瘤、心血管疾病之后第三大嚴(yán)重威脅人類健康的慢性疾病。糖尿病是由于胰島素分泌缺陷和（或）胰島素作用缺陷而引起慢性血葡萄糖水平增高為特征的代謝性疾病。目前糖尿病的治療方法多種多樣，主要有口服降糖藥治療、胰島素及其類似物治療、干細(xì)胞及胰島細(xì)胞移植治療等。但由于缺乏針對病因的治療，其治療效果不盡如人意。因此進(jìn)一步尋求糖尿病治療新靶點和尋求更好的糖尿病治療方

2、法一直是醫(yī)學(xué)研究的熱點。 RNA干擾（RNA interference，RNAi）是生物體內(nèi)的一種自然現(xiàn)象：導(dǎo)入生物體內(nèi)的或內(nèi)源性轉(zhuǎn)錄生成的一種雙鏈RNA分子，與同源的mRNA結(jié)合并使其降解，可介導(dǎo)對應(yīng)基因轉(zhuǎn)錄后的沉默，是近年發(fā)現(xiàn)的一種沉默基因表達(dá)的新方法，特異性地阻斷或降低相應(yīng)基因表達(dá)，從而具有治療某些因基因過表達(dá)或基因突變引起的疾病的應(yīng)用前景。在胰島素分泌的鈣離子-ATP酶通路中，PMR1（plasma membrane-

3、related Ca2+-ATPase-1）是存在于高爾基體及高爾基囊泡上與鈣轉(zhuǎn)運相關(guān)的ATP酶，在胰島素的正常分泌過程中起重要作用。研究發(fā)現(xiàn)抗PMR1的siRNA可特異性沉默PMR1 mRNA的表達(dá)，減少內(nèi)源性PMR1蛋白表達(dá)，引起鈣離子內(nèi)流增加，從而導(dǎo)致胰島素分泌。抑制PMR1基因的表達(dá)可幫助糖尿病患者和胰島移植患者的β細(xì)胞分泌胰島素，有望成為治療糖尿病的新靶點。本實驗利用RNAi技術(shù)，研究合成的siPMR1分子在體外培養(yǎng)的胰島β細(xì)

4、胞株NIT-1中對靶基因的沉默作用，并探討對該胰島細(xì)胞分泌胰島素的影響。為用RNAi技術(shù)沉默PMR1靶點治療糖尿病提供了理論基礎(chǔ)。 目的： 1．鑒定NIT-1細(xì)胞中PMR1基因的表達(dá)。 2．采用RNA干擾技術(shù)（RNAi），研究體外合成的siPMR1分子對NIT-1細(xì)胞中高爾基體膜上鈣離子ATP酶1（plasma membrane-related Ca2+-ATPase-1，PMR1）的基因沉默作用。 3．

5、觀察沉默PMR1基因?qū)σ葝u素分泌的影響。 方法： 1．細(xì)胞培養(yǎng) 胰島β細(xì)胞株NIT-1傳代培養(yǎng)于含10%胎牛血清、75mg/L青霉素及50mg/L鏈霉素的低糖DMEM培養(yǎng)液中，培養(yǎng)條件為37℃、5%CO2、飽和濕度。本實驗所用的胰島β細(xì)胞株NIT-1由中山大學(xué)附屬二院內(nèi)分泌科實驗室惠贈。 2．胰島β細(xì)胞NIT-1中PMR1 mRNA的PCR鑒定 收集NIT-1細(xì)胞，按Trizol說明書操作提取細(xì)胞

6、總RNA。用紫外分光光度計測定OD260及OD280值，計算得OD260/OD280比值均大于1．8，說明所提取的RNA質(zhì)量可靠，可進(jìn)行下一步試驗。按照TOYOBO逆轉(zhuǎn)錄試劑盒提供的方法，將約1μg總RNA于20μL總反應(yīng)體積內(nèi)逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。根據(jù)PMR1的cDNA序列和內(nèi)參GAPDH的cDNA序列，設(shè)計合成兩對特異性寡核苷酸引物，PMR1 cDNA序列的上游PCR引物：5'-GTTAGTCATAGGCGAGC-3'，下游引物：5'

7、-GTCCATGCTCTTCTGCAG-3'，擴增片段長度約為640bp。GAPDHcDNA序列的上游PCR引物：5'-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3'，下游引物：5'-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3'，擴增片段長約為450bp。PCR反應(yīng)體系為：模板cDNA1．5μL，PMR1上下游引物（10μM）各0．5μL，GAPDH上下游引物（10μM）各0．25μL，ddH2O16．75μL，其余組份同PCR試劑盒

8、說明書，退火溫度56．5℃。PCR產(chǎn)物用1．2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測并用凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行成像分析。每個樣品均重復(fù)2個反應(yīng)。 3．siRNA轉(zhuǎn)染 更換新鮮培養(yǎng)液后調(diào)整細(xì)胞濃度為1×105個/μL，分別以每孔4μL和100μL接種于直徑6 cm的培養(yǎng)皿和96孔板中，待細(xì)胞增殖融合至50%～80%時，換用不含雙抗的胎牛血清，含終濃度為100 nM siRNA的DMEM培養(yǎng)液，6h后換含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)至

9、隨后檢測各指標(biāo)。 本實驗中合成的抗PMR1的siRNA（siPMR1）分子序列為： 正義鏈：5'-GUUAGUCAUAGGCGAGCCUdTdT-3'； 反義鏈：5'-AGGCUCGCCUAUGACUAACdTdT-3'。 陰性對照siRNA序列為： 正義鏈：5'-CGUGAUUGCGAGACUCUGAdTdT-3'； 反義鏈：5'-UCAGAGUCUCGCAAUCACGdTdT-3'。

10、 實驗分為三組：①空白轉(zhuǎn)染組（轉(zhuǎn)染復(fù)合液僅含脂質(zhì)體）；②對照轉(zhuǎn)染組（轉(zhuǎn)染復(fù)合液含脂質(zhì)體+陰性對照siRNA）；③siPMR1組（轉(zhuǎn)染復(fù)合液含脂質(zhì)體+siPMR1）。參照Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑說明書提供的方法進(jìn)行轉(zhuǎn)染。 4．檢測小鼠NIT-1細(xì)胞中PMR1 mRNA的基因沉默 合成能特異性沉默靶基因PMR1的siRNA分子（siPMR1），體外轉(zhuǎn)染NIT-1細(xì)胞，采用半定量RT-PCR方法檢測si

11、RNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞后的基因沉默功能。步驟如下：收集轉(zhuǎn)染24h后的細(xì)胞，用PBS洗2次，按第二部分中2．3．2提供的方法提取細(xì)胞中總RNA并進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，PCR條件同2．3．2，PCR產(chǎn)物用1．2%的瓊脂糖凝膠電泳分離，成像后用軟件Image J測定條帶灰度，并比較分析siPMR1分子對目標(biāo)PMR1基因的沉默效應(yīng)。 5．胰島素測定 96孔板中細(xì)胞轉(zhuǎn)染siRNA分子后24h、36h、48h后收集各孔細(xì)胞培養(yǎng)液100μL，置-30℃

12、冰箱備用。胰島素水平測量按125Ⅰ胰島素放射免疫分析藥盒說明書操作。 6．統(tǒng)計學(xué)方法 計量資料的數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±S）表示，采用SPSS13．0統(tǒng)計軟件中析因分析及單項方差分析方法進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，先做方差齊性檢驗，組間多重比較根據(jù)方差齊性與否采用LSD檢驗或Dunnett T3法，以α=0．05為顯著性水平。 結(jié)果： 1．本實驗從培養(yǎng)的NIT-1細(xì)胞中提取總的RNA，通過半定量RT-PCR方法進(jìn)行了

13、鑒定，PCR產(chǎn)物用1．2%的瓊脂糖電泳分離后可見有兩條特異性條帶，分別長約450 bp和640 bp，與預(yù)期的陰性對照GAPDH的條帶和目的基因PMR1的條帶大小相符。 2．細(xì)胞轉(zhuǎn)染24小時后，提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄后，用PCR方法檢測其中目的基因PMR1表達(dá)的豐度，GAPDH為內(nèi)參，各組均可見有兩條特異性DNA片段（PMR1和GAPDH），大小與預(yù)期相符；測各組泳道中各DNA片段的灰度，統(tǒng)計學(xué)分析結(jié)果示各組間PMR1 mRNA的

14、相對表達(dá)量具有顯著性差異（p<0．05）。經(jīng)組間多重比較，siPMR1轉(zhuǎn)染組中PMR1 mRNA表達(dá)水平較空白轉(zhuǎn)染組和對照轉(zhuǎn)染組均有顯著下降（p<0．05），而空白轉(zhuǎn)染組和對照轉(zhuǎn)染組兩組之間比較無顯著性差異（P=0．563）。 3．所測實驗各組胰島素結(jié)果經(jīng)析因設(shè)計的方差分析后，結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染方法及轉(zhuǎn)染時間之間具有顯著的統(tǒng)計學(xué)差異，且轉(zhuǎn)染方法與轉(zhuǎn)染時間之間存在交互效應(yīng)；不同方法及時間的各組胰島素結(jié)果經(jīng)單項方差分析結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染siPM