CDC42對(duì)胰島β細(xì)胞胰島素分泌的調(diào)節(jié)作用及其機(jī)制.pdf

1、研究背景和目的：
　　糖尿病是由于體內(nèi)胰島素分泌失衡或外周組織對(duì)胰島素抵抗導(dǎo)致胰島素絕對(duì)或相對(duì)不足，導(dǎo)致的機(jī)體血糖持續(xù)升高，進(jìn)而繼發(fā)多組織器官損傷。CDC42是一個(gè)Rho家族GTPases的成員，有研究表明其具有調(diào)控胰島素分泌的作用。本課題旨在利用胰島β細(xì)胞特異性敲除CDC42小鼠模型進(jìn)一步確定CDC42在葡萄糖刺激誘導(dǎo)胰島素分泌（GSIS）過(guò)程中的可能分子信號(hào)通路，從而為闡明CDC42在胰島β細(xì)胞分泌胰島素中的作用及其機(jī)制提供實(shí)

2、驗(yàn)依據(jù)。
　　方法：
　　1.利用生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)分析CDC42在小鼠主要器官和不同年齡時(shí)胰腺中的表達(dá)情況；
　　2.制備胰島β細(xì)胞特異性敲除CDC42小鼠，PCR鑒定小鼠基因型并分離胰島細(xì)胞Western blot分析小鼠是否構(gòu)建成功；
　　3．分離小鼠的胰島以及制備抑制CDC42活性的MIN6細(xì)胞模型，分別檢測(cè)β細(xì)胞在低糖、高糖、KCl刺激后胰島素的分泌量并檢測(cè)胰島素基因的表達(dá)情況；
　　4.利用免疫熒

3、光技術(shù)，在熒光顯微鏡觀察CDC42和胰島素在不同條件刺激后的亞細(xì)胞分布，探討β細(xì)胞結(jié)構(gòu)功能的變化情況；
　　5.機(jī)制分析：β細(xì)胞負(fù)載鈣離子探針（Fluo-3 AM），實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)細(xì)胞在不同條件刺激下胞內(nèi)鈣的動(dòng)態(tài)變化；Q-PCR分析鈣調(diào)節(jié)相關(guān)蛋白（NCX，SERCA,IP3R等）mRNA水平上的表達(dá)情況；Western blot檢測(cè)相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子，進(jìn)一步確定CDC42通過(guò)調(diào)控胞內(nèi)鈣參與GSIS的作用機(jī)制。
　　結(jié)果：
　　1.

4、CDC42在小鼠內(nèi)分泌系統(tǒng)和神經(jīng)系統(tǒng)的組織中表達(dá)量較高，在胰腺中有一定的表達(dá)，且在胚胎14天左右，CDC42在胰腺組織表達(dá)明顯增加，在出生前達(dá)表達(dá)高峰，從出生至成年CDC42表達(dá)量維持一定的豐度；
　　2.基因型鑒定和Western blot確定小鼠基因型，結(jié)果顯示胰島β細(xì)胞特異性敲除CDC42小鼠，其胰島中的CDC42表達(dá)量顯著下調(diào)80％；
　　3.胰島β細(xì)胞特異性敲除CDC42的胰島β細(xì)胞下調(diào)GSIS中胰島素的分泌，抑制

5、CDC42活性同樣導(dǎo)致MIN6細(xì)胞胰島素分泌量減少；
　　4.在MIN6細(xì)胞系中抑制 CDC42活性導(dǎo)致胰島素顆粒在胞膜附近大量積聚，MIN6細(xì)胞出現(xiàn)分泌功能障礙的表型；
　　5.在β細(xì)胞中敲除CDC42或在MIN6細(xì)胞中抑制CDC42活性都減弱GSIS中[Ca2+]c的上調(diào)，且Q-PCR結(jié)果顯示Calmodulin、Calcineurin和IP3R基因等鈣調(diào)相關(guān)基因表達(dá)改變；同時(shí)敲除CDC42小鼠胰島組織中Foxa2表達(dá)明