LRIG3基因在膀胱尿路上皮癌中的表達及重組腺病毒載體rAd-LRIG3感染T24細胞的實驗研究.pdf

1、近年來研究發(fā)現，LRIGs基因家族在多種腫瘤中具有抑癌作用，其可能的機制是下調EGFR的表達，從而抑制EGF對人體腫瘤所帶來的促細胞增殖、侵襲等作用。但其在膀胱癌中的作用報道甚少，本研究檢測了LRIG3基因及蛋白在膀胱癌中的表達，并將其重組腺病毒質粒感染人膀胱癌T24細胞系，觀察了LRIG3對T24細胞生長、凋亡及遷移的影響等，分三個部分簡述如下。
　　 第一部分：LRIG3 蛋白及基因在膀胱腫瘤中的表達及意義
　　 目

2、的：了解LRIG3蛋白及基因在膀胱腫瘤和正常膀胱組織中的表達及其與膀胱腫瘤不同分級、分期之間的關系。
　　 方法：采用免疫組化SP法和逆轉錄-聚合酶鏈反應（RT-PCR）法檢測64例膀胱尿路上皮癌組織和12例正常膀胱粘膜中LRIG3蛋白及mRNA的表達情況，并結合臨床資料進行分析。
　　 結果：膀胱癌組織中LRIG3 蛋白和mRNA的表達水平顯著低于正常膀胱黏膜組織；且分級和分期越高，LRIG3蛋白和mRNA的表達水平越

3、低。
　　 結論：LRIG3基因在膀胱癌中存在表達缺失和低表達，提示LRIG3基因在膀胱癌的發(fā)生發(fā)展中可能具有抑癌基因的作用，有可能成為腫瘤基因治療的又一靶點。
　　 第二部分：LRIG3基因特異性腺病毒表達載體的構建與鑒定
　　 目的: 構建并鑒定含有LRIG3基因的腺病毒表達載體rAd-LRIG3，并感染人膀胱癌細胞T24，為后期檢測LRIG3對膀胱癌生物學行為的影響提供靶細胞。
　　 方法：通過質粒

4、提取、瓊脂糖凝膠電泳、酶切、連接、轉化等多種基因工程技術，從感受態(tài)大腸桿菌DH5α菌株中提取并大量制備pLRIG3-EGFP真核表達質粒，然后對其行限制性內切酶酶切、凝膠電泳法進行鑒定。測序正確后，利用腺病毒載體系統(tǒng)Adeno-X構建重組腺病毒質粒pAd-LRIG3，酶切、PCR鑒定重組腺病毒質粒，鑒定正確后，將pAd-LRIG3轉染至HEK293細胞，包裝成復制缺陷型腺病毒質粒rAd-LRIG3。大量擴增rAd-LRIG3，測病毒滴度

5、。實驗分為三組：實驗組（T24-LRIG3組，感染rAd-LRIG3）、對照組（T24組，未感染腺病毒質粒）和感染空載體組（T24-HK組，感染rAd-HK）。感染48小時后，應用RT-PCR及Western-Blotting鑒定該質粒在細胞中是否得到表達。
　　 結果:酶切分析、測序鑒定表明rAd-LRIG3構建成功；RT-PCR及W-B分析表明，T24-LRIG3組中LRIG3mRNA及蛋白的表達水平較T24-HK組和T24

6、組明顯升高，差異有顯著性（P<0.05）。
　　 結論: 攜帶有LRIG3基因的重組腺病毒構建成功；建立了rAd-LRIG3感染人膀胱癌細胞T24的長期穩(wěn)定細胞系。可能為尋找膀胱癌的有效基因治療途徑奠定基礎。
　　 第三部分：LRIG3基因對膀胱癌細胞T24 生物學行為的影響
　　 目的：研究LRIG3基因對膀胱癌細胞T24生物學行為的影響。以判斷LRIG3基因在膀胱癌的發(fā)生和進展方面是否具有作用；進而說明LRI

7、G3基因是否是膀胱癌病因學中的一個抑癌基因。
　　 方法：利用重組腺病毒質粒rAd-LRIG3感染膀胱癌細胞T24，得到穩(wěn)定細胞株T24-LRIG3，細胞計數并繪制細胞生長曲線；Hoechst33258 染色、透射電鏡、流式細胞儀檢測細胞凋亡情況；細胞遷移實驗觀察感染后細胞侵襲能力的變化。實驗分為三組：實驗組（T24-LRIG3組，感染rAd-LRIG3）、對照組（T24組，未感染腺病毒質粒）和感染空載體組（T24-HK組，感染

8、rAd-HK）。
　　 結果：MTT法觀察顯示，感染rAd-LRIG3后細胞生長增殖速度較未感染組和空載體感染組明顯減慢；Hoechst33258 染色及透射電鏡顯示部分細胞呈現凋亡形態(tài)學改變；流式細胞儀定量檢測表明感染LRIG3基因后，T24細胞出現較為明顯的凋亡峰；細胞遷移力顯著低于未轉染組和空載體轉染組。
　　 結論：LRIG3基因能有效抑制膀胱癌細胞的生長增殖和遷移，并誘導細胞的凋亡，是膀胱癌病因學中的一個抑癌基