HMGB1在膀胱尿路上皮癌中的表達及其對T24細胞株生物學行為影響的研究.pdf

1、背景:膀胱癌是泌尿生殖系統(tǒng)中的常見腫瘤，其中90％的組織學類型為膀胱尿路上皮癌(bladder urothelial carcinoma，BUC)。盡管經(jīng)過了多年的深入研究和探索，但BUC發(fā)生發(fā)展的分子生物學機制仍不十分明朗。目前針對BUC的各種治療手段仍不能讓人完全滿意，BUC患者的總體預后仍不容樂觀。因此，深入研究探索BUC發(fā)生發(fā)展相關的分子生物學機制對于提高BUC的診療水平和改善BUC患者的預后具有十分重大的價值。
　　高遷

2、移率族蛋白1(high-mobility group box1，HMGB1)是一種在真核生物的細胞中廣泛表達且高度保守的非組蛋白核蛋白。近年來研究發(fā)現(xiàn)，HMGB1與腫瘤的無限增殖，抵抗凋亡，新生血管生成，浸潤轉移等生物學行為密切相關，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起到了重要的作用。但目前國內外對于HMGB1在BUC中的表達研究較少，其對BUC生物學行為的影響及其在BUC發(fā)生發(fā)展中所起的作用還不清楚。
　　目的:(1)研究HMGB1在BUC組織

3、及細胞株中的表達情況，分析HMGB1的表達和BUC臨床病理因素之間的關系。(2)探索構建靶向HMGB1的短發(fā)夾RNA(short hairpin RNA，shRNA)表達載體并轉染人BUC細胞株T24來特異性的沉默HMGB1基因的表達。(3)研究shRNA介導的RNA干擾對T24細胞HMGB1表達的影響及T24細胞生物學活性的變化。(4)初步研究HMGB1影響人BUC細胞生物學行為可能的下游作用機制。
　　方法:(1)收集30例B

4、UC組織及其配對的癌旁組織，采用Western-blot和實時熒光定量-PCR(real-time polymerase chainreaction，Real-time PCR)分析BUC組織和細胞中HMGB1的表達水平，同時采用免疫組織化學法（immunohistochemistry，IHC）檢測HMGB1蛋白的表達程度和定位，分析其表達水平和BUC臨床病理因素之間的關系。(2)探索構建靶向HMGB1基因的pGPU6/GFP/Neo-

5、shRNA表達載體并采用脂質體lipofectamineTM2000轉染T24細胞來特異性的沉默HMGB1的表達，采用Western-blot和Real-time PCR檢測shRNA干擾序列對HMGB1表達的影響。(3)采用MTT法、流式細胞術、Transwell實驗研究pGPU6/GFP/Neo-HMGB1 shRNA-539表達載體轉染的T24細胞增殖、凋亡、遷移、侵襲和細胞周期的變化。(4)采用Western-blot和Real

6、-time PCR檢測HMGB1干擾序列轉染T24細胞后核轉錄因子-κB(nuclear factor kappa B/p65，NF-κB/p65)和血管內皮細胞生長因子-C(vascular endothelial growth factor-C，VEGF-C)的表達水平，同時采用間接免疫熒光法(indirectimmunofluorescence)和酶聯(lián)免疫吸附實驗(enzyme-linkedimmunosorbent assay，

7、ELISA)來分別檢測NF-κB/p65在細胞內的定位情況和活性變化。
　　結果:(1) HMGB1在BUC組織中高表達，其表達水平顯著高于配對的癌旁組織;IHC結果顯示HMGB1的陽性染色顆粒絕大部分位于細胞核，少部分位于細胞漿;結合患者的臨床病理資料進行分析發(fā)現(xiàn)HMGB1的表達水平與患者的組織學分級和TNM分期呈正相關;同時，HMGB1在5637、BIU-87和T24細胞中的表達水平逐次升高，與BUC細胞的惡性程度相關。(2)

8、實驗成功的構建了特異性干擾HMGB1基因的pGPU6/GFP/Neo-shRNA表達載體并成功轉染T24細胞;經(jīng)檢測3條shRNA均可以特異性的抑制HMGB1的表達，其中以HMGB1 shRNA-539抑制效率最高。(3)特異性的干擾HMGB1基因的表達能在體外抑制T24細胞增殖、遷移、侵襲能力并誘導細胞周期G0/G1期遲滯和細胞凋亡。(4) HMGB1干擾序列轉染T24細胞后NF-κB/p65和VEGF-C的表達水平下調;同時NF-κ

9、B/p65的核轉位減少活性降低。
　　結論:(1) HMGB1的表達水平在BUC組織和細胞中明顯增高，且與BUC的組織學分級和TNM分期正相關，HMGB1可能與BUC的發(fā)生發(fā)展密切相關。(2)特異性的下調T24細胞HMGB1的表達可以顯著抑制其增殖、遷移、侵襲能力并誘導細胞周期G0/G1期遲滯和細胞凋亡，HMGB1可以作為BUC基因治療的一個潛在靶點。(3)特異性的下調T24細胞HMGB1基因的表達可以引起細胞中NF-κB/p65