LRIG3基因在三種膀胱癌細(xì)胞系中的表達(dá)及對其細(xì)胞周期、侵襲性和凋亡的影響.pdf

1、背景及目的：
　　近年來許多研究表明,LRIGs基因家族在垂體瘤、神經(jīng)膠質(zhì)瘤和皮膚鱗狀細(xì)胞癌等多種腫瘤中具有抑癌作用,分析其機(jī)制可能是通過下調(diào) EGFR的表達(dá)抑制腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲等作用。但是對于其在膀胱癌方面的研究較少,尤其是對于多種膀胱癌細(xì)胞株生物學(xué)行為的檢測分析還未見報(bào)道。
　　本實(shí)驗(yàn)的目的在于,建立穩(wěn)定表達(dá) LRIG3基因的多種膀胱癌細(xì)胞株,系統(tǒng)觀察分析 LRIG3對穩(wěn)定表達(dá) LRIG3基因的膀胱癌細(xì)胞系 EJ、T

2、24和BIU-87在生長、侵襲及凋亡等方面的影響,全面評價(jià) LRIG3基因?qū)Π螂装┑淖饔眉翱赡軝C(jī)制。
　　方法：
　　提取目的基因,通過瓊脂糖凝膠電泳、限制性酶切、連接、轉(zhuǎn)化入感受態(tài)大腸桿菌 DH5α菌株并從中提取并大量制備 pLVX-DsRed-LRIG3真核表達(dá)質(zhì)粒,然后再進(jìn)行限制性內(nèi)切酶酶切、瓊脂糖凝膠電泳法及DNA測序進(jìn)行鑒定。鑒定正確無誤后,轉(zhuǎn)染入 EJ、T24和BIU-87膀胱癌細(xì)胞中。通過 RT-PCR和Wes

3、tern Blotting技術(shù)測定各組膀胱癌細(xì)胞 LRIG3 mRNA和蛋白的表達(dá)。使用Transwell小體測定 EJ、T24和BIU-87膀胱癌細(xì)胞株各組的體外侵襲能力。運(yùn)用Annexin-V/7-aad雙染法檢測三種膀胱癌細(xì)胞的凋亡情況。采用流式細(xì)胞儀觀察分析 LRIG3對三種膀胱癌細(xì)胞的誘導(dǎo)效應(yīng)。
　　結(jié)果：
　　經(jīng)過限制性酶切、PCR及DNA測序鑒定,pLVX-DsRed-Monomer-LRIG3構(gòu)建成功,與對照

4、組相比,三種膀胱癌細(xì)胞株 EJ、T24和BIU-87實(shí)驗(yàn)組 LRIG3 mRNA的表達(dá)水平分別上升79.2％、68.6％和60.3％,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);LRIG3蛋白的表達(dá)水平則分別上升90.5％、78.6％和68.2％,差異顯著(P<0.05)。實(shí)驗(yàn)組作用24h后三種膀胱癌細(xì)胞株 EJ、T24和BIU-87的增殖和侵襲能力顯著減弱。過表達(dá)的LRIG3基因誘導(dǎo) EJ和T24細(xì)胞 S+G2/M期阻滯:結(jié)果表明,實(shí)驗(yàn)組 E

5、J和T24細(xì)胞中S期和G2/M期細(xì)胞數(shù)之和顯著低于對照組(P<0.05)。BIU-87細(xì)胞變化未見明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。凋亡檢測結(jié)果顯示在 EJ、T24和BIU-87細(xì)胞中,實(shí)驗(yàn)組的凋亡細(xì)胞均顯著多于對照組。
　　結(jié)論：
　　使用慢病毒載體系統(tǒng)成功構(gòu)建攜帶有 LRIG3基因的重組質(zhì)粒并將其成功轉(zhuǎn)染膀胱癌細(xì)胞株;轉(zhuǎn)染后的三種膀胱癌細(xì)胞株,LRIG3 mRNA和蛋白水平都明顯提高,實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明 LRIG3可以明顯降低膀胱癌細(xì)胞的侵襲能

6、力,阻滯膀胱癌細(xì)胞生長和促進(jìn)膀胱癌細(xì)胞的凋亡。
　　第一部分
　　LRIG3基因表達(dá)載體的構(gòu)建及在膀胱癌細(xì)胞中的表達(dá)
　　目的:獲取目的基因 LRIG3,與真核表達(dá)載體連接,構(gòu)建并鑒定 LRIG3穩(wěn)定表達(dá)質(zhì)粒,并將其分別轉(zhuǎn)染入 EJ、T24和BIU-87細(xì)胞中,為下一步檢測 LRIG3對膀胱癌三種細(xì)胞生物學(xué)行為的影響提供穩(wěn)定表達(dá)質(zhì)粒。
　　方法:對質(zhì)粒進(jìn)行提取、瓊脂糖凝膠電泳、限制性酶切、連接、轉(zhuǎn)化等操作,轉(zhuǎn)化入

7、感受態(tài)大腸桿菌 DH5α菌株并從中提取并大量制備 pLVX--DsRed-LRIG3真核表達(dá)質(zhì)粒,然后再進(jìn)行限制性內(nèi)切酶酶切、瓊脂糖凝膠電泳法及DNA測序進(jìn)行鑒定。鑒定正確無誤后,將其作為實(shí)驗(yàn)組,命名為 pLVX-DsRed-Monomer-LRIG3,將pLVX-DsRed-Monomer-N1空白質(zhì)粒作為對照組,命名為 pLVX- CON,將經(jīng)酶切、PCR鑒定正確后,將 pLVX-DsRed-Monomer-LRIG3和pLVX-

8、CON分別轉(zhuǎn)染入 EJ、T24和BIU-87細(xì)胞中,測定 LRIG3 mRNA和蛋白的表達(dá)。
　　結(jié)果:經(jīng)過限制性酶切、PCR及DNA測序鑒定,pLVX-DsRed-Monomer-LRIG3構(gòu)建成功,與對照組相比,三種膀胱癌細(xì)胞株 EJ、T24和BIU-87實(shí)驗(yàn)組 LRIG3 mRNA的表達(dá)水平分別上升79.2％、68.6％和60.3％,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);LRIG3蛋白的表達(dá)水平則分別上升90.5％、78.6％

9、和68.2％,差異顯著(P<0.05)。說明在三種膀胱癌細(xì)胞株中LRIG3過表達(dá)重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染成功。
　　結(jié)論:攜帶有 LRIG3基因的重組質(zhì)粒構(gòu)建成功;在三種膀胱癌細(xì)胞株中LRIG3 mRNA和蛋白水平都明顯提高,為下一步檢測 LRIG3基因?qū)Π螂装┘?xì)胞生物學(xué)行為的影響奠定基礎(chǔ)。
　　第二部分
　　LRIG3基因?qū)θN膀胱癌細(xì)胞細(xì)胞周期、侵襲性和凋亡的影響
　　目的:通過研究 LRIG3基因?qū)Π螂装┘?xì)胞 EJ、T

10、24和BIU-87生物學(xué)行為的影響,以分析 LRIG3基因?qū)Π螂装┑陌l(fā)生發(fā)展方面的作用;進(jìn)而探討 LRIG3基因在膀胱癌的診療方面的潛在價(jià)值。
　　方法:常規(guī)培養(yǎng) EJ、T24和BIU-87膀胱癌細(xì)胞,將重組質(zhì)粒
　　pLVX-DsRed-Monomer-LRIG3和空白質(zhì)粒通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法轉(zhuǎn)染入三種膀胱癌細(xì)胞中,分為實(shí)驗(yàn)組(轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒 pLVX-DsRed-Monomer-LRIG3)、對照組(轉(zhuǎn)染空白質(zhì)粒 pLVX-

11、CON)和未轉(zhuǎn)染組。CCK-8比色法檢測膀胱癌細(xì)胞增殖能力。Transwell小體法檢測 EJ、T24和BIU-87膀胱癌細(xì)胞株的體外侵襲能力。運(yùn)用Annexin-V/7-aad雙染法檢測三種膀胱癌細(xì)胞的凋亡情況。采用流式細(xì)胞儀分析 LRIG3對三種膀胱癌細(xì)胞的誘導(dǎo)效應(yīng)。
　　結(jié)果:與對照組比較,實(shí)驗(yàn)組作用24h后三種膀胱癌細(xì)胞株 EJ、T24和BIU-87增值能力和侵襲能力顯著減弱。過表達(dá)的LRIG3基因誘導(dǎo) EJ和T24細(xì)胞