LRIG3在宮頸鱗癌組織中的表達及體內(nèi)外干擾LRIG3表達的實驗研究.pdf

1、背景:
　　宮頸癌是全世界范圍內(nèi)同時也是我國最常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)生率位居女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤第一位，且有逐年年輕化的趨向。近年來，隨著手術(shù)切除、化學治療、放射治療、及其它綜合性治療措施的應用，對宮頸癌的治療有了一定程度的進展，但療效并不十分理想。宮頸癌的病因及發(fā)生機制目前尚不十分明了，許多研究證明其發(fā)生、發(fā)展和浸潤、轉(zhuǎn)移是多因素、多階段、多基因共同參與的非常復雜的過程，因此，探討宮頸癌的發(fā)病機制，尋找更有效的治療措施是當前研

2、究的熱點課題之一。
　　LRIGs是最近發(fā)現(xiàn)的一組腫瘤相關(guān)基因，該家族共有三個成員:LRIG1、LRIG2、LRIG3。LRIGs編碼一組結(jié)構(gòu)上較為相似的膜整合蛋白，蛋白分為胞外段、跨膜區(qū)和一個胞漿內(nèi)尾巴，胞外段蛋白含有富含亮氨酸重復序列（LRRs）和3個免疫球蛋白樣結(jié)構(gòu)域。研究表明LRIG的表達能夠?qū)GFR信號通路進行調(diào)控，從而起到抑制腫瘤生長的作用，但是我們對其分子和信號機制尚不清楚。近年來許多研究表明，LRIGs基因家族在

3、垂體瘤、神經(jīng)膠質(zhì)瘤和皮膚鱗狀細胞癌等多種腫瘤中具有抑癌作用。
　　LRIG3定位于人類基因組12q13，在人類腫瘤中LRIG3是高表達還是低表達尚不十分清楚，對于其在宮頸癌中表達的相關(guān)研究較少，對于其在宮頸癌細胞株中發(fā)揮的生物學作用尚未見報道。LRIG3和宮頸癌的發(fā)生發(fā)展是否有相關(guān)性，抑制LRIG3表達對宮頸鱗癌的影響是本研究需要探討的核心。
　　目的:
　　檢測宮頸鱗癌組織、宮頸上皮內(nèi)瘤變組織和正常宮頸粘膜組織中LR

4、IG3、EGFR和Ki67的表達，并分析其與宮頸鱗癌浸潤轉(zhuǎn)移的關(guān)系。觀察LRIG3反義核苷酸轉(zhuǎn)染到宮頸癌Hela229細胞中后對LRIG3和EGFR的表達以及對細胞增殖、轉(zhuǎn)移以及細胞周期的影響。觀察LRIG3反義核苷酸對宮頸癌裸鼠移植瘤的影響。
　　第一部分LRIG3在宮頸鱗癌組織中的表達及意義
　　方法:
　　應用免疫組織化學和原位雜交檢測45例宮頸鱗癌組織、20例CIN組織和30例正常宮頸黏膜組織中LRIG3、EG

5、FR和Ki67表達，并結(jié)合臨床病理資料對結(jié)果進行分析。
　　結(jié)果:
　　1.LRIG3蛋白和mRNA在宮頸鱗狀細胞癌組織中的陽性表達率分別為35.56％和48.89％，顯著低于CIN組織（分別為70％、80％）和正常宮頸粘膜組織（皆為100％），兩兩間比較差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。其蛋白和mRNA的表達強度與/和患者的年齡以及腫瘤大小無關(guān)（P均＞0.05），而與腫瘤的浸潤程度、臨床分期以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移成負相關(guān)（P均＜

6、0.05）。
　　2.EGFR蛋白和mRNA在宮頸鱗狀細胞癌組織中的陽性表達率分別為80％和84.44％，顯著高于CIN組織（分別為35％、45％）和正常宮頸粘膜組織（分別為6.67％、16.67％），兩兩間比較差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。在宮頸鱗狀細胞癌組織中EGFR蛋白和mRNA的表達強度與患者的年齡、腫瘤大小、臨床分期無關(guān)（P均＞0.05），而與腫瘤的浸潤程度以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移成正相關(guān)(P均＜0.05)。
　　3.

7、Ki67蛋白和mRNA在宮頸鱗狀細胞癌組織中的陽性表達率分別為86.67％和91.11％，顯著高于CIN組織（分別為30％和50％）和正常宮頸粘膜組織（分別為3.33％、23.33％），兩兩間比較差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。Ki-67的表達與宮頸鱗癌各臨床病理因素均無相關(guān)性((P＞0.05)。
　　4.LRIG3和EGFR在宮頸鱗狀細胞癌組織中的表達呈負向相關(guān)，LRIG3和Ki67在宮頸鱗狀細胞癌組織中的表達亦呈負向相關(guān)。

8、
　　第二部分LRIG3的表達調(diào)控對宮頸鱗癌Hela229細胞周期、凋亡、侵襲力的影響
　　方法:
　　1.設計合成LRIG3反義寡核苷酸(LRIG3ASODN)、正義寡核苷酸序列(LRIG3SODN)以及錯義寡核苷酸序列(LRIG3MSODN)，用脂質(zhì)體Lipofectamine2000包裹轉(zhuǎn)染Hela229細胞，作為轉(zhuǎn)染組細胞。將脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的細胞作為空白對照組細胞。
　　2.Westernblot檢測不同濃度

9、(150μg/ml、200μg/ml、250μg/ml)LRIG3ASODN、LRIG3MSODN和LRIG3SODN轉(zhuǎn)染細胞24h、48h及72h后LRIG3和EGFR蛋白表達情況。
　　3.RT-PCR檢測不同濃度(150μg/ml、200μg/ml、250μg/ml)LRIG3ASODN、LRIG3MSODN和LRIG3SODN轉(zhuǎn)染細胞24h、48h及72h后LRIG3和EGFRmRNA表達情況。
　　4.應用MTT檢

10、測細胞增殖情況，細胞流式法測定細胞凋亡，細胞基質(zhì)粘附實驗檢測細胞粘附能力，Transwell小室法檢測細胞的侵襲能力。
　　結(jié)果:
　　1.ASODN組中LRIG3蛋白和mRNA表達較SODN組、MSODN組、空白對照組明顯降低(P＜0.05)，且有濃度依賴性和時間依賴性，LRIG3的表達隨轉(zhuǎn)染濃度的增加以及時間的延長而減少。
　　2.ASODN組中EGFR蛋白和mRNA表達較SODN組、MSODN組、空白對照組明顯增

11、加(P＜0.05)，隨轉(zhuǎn)染濃度的增加及時間的延長EGFR的表達隨之升高。EGFR表達和LRIG3表達呈負相關(guān)。
　　3.MTT實驗表明LRIG3ASODN組Hela229細胞增殖率較其它組別明顯升高(P＜0.05)，隨著LRIG3ASODN轉(zhuǎn)染濃度增加，表達抑制時間延長，細胞增殖率明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　4.轉(zhuǎn)染LRIG3ASODN后Hela229細胞凋亡率明顯降低，隨著轉(zhuǎn)染濃度的增加，時間延長，細

12、胞的凋亡率隨之降低。
　　5.細胞基質(zhì)粘附實驗表明轉(zhuǎn)染LRIG3ASODN后使Hela229細胞粘附率明顯增高，隨著轉(zhuǎn)染濃度的增加，時間延長，細胞的粘附率隨之升高。
　　6.Transwell實驗表明轉(zhuǎn)染LRIG3ASODN后使得Hela229細胞的遷徙能力明顯增高，ASODN組穿膜細胞數(shù)(246±10)明顯高于SODN組(168±10)、MSODN組（177±8）和空白對照組(176±6)。
　　第三部分LRIG3表

13、達調(diào)控對人宮頸鱗癌裸鼠移植瘤生長的影響
　　方法:
　　將1×107個Hela229細胞注射到裸鼠皮下構(gòu)建宮頸鱗癌裸鼠移植瘤模型，將LRIG3ASODN皮下注射到瘤體內(nèi)后觀察裸鼠移植瘤的生長狀態(tài)。測量各組種植瘤瘤體體積。Westemblot和RT-PCR檢測裸鼠移植瘤中LRIG3和EGFR蛋白和mRNA表達。
　　結(jié)果:
　　1.ASODNLRIG3組注射后18-30天裸鼠細胞瘤體積較其它兩組明顯增高(P＜0.0

14、5)。
　　2.Westemblot和PT-PCR檢測裸鼠移植瘤中LRIG3蛋白和mRNA表達，顯示ASODN組LRIG3表達較MSODN和空白對照組明顯降低(P＜0.05)。
　　3.Westernblot和PT-PCR檢測裸鼠移植瘤中EGFR蛋白和mRNA表達，顯示ASODN組EGFR表達較MSODN和空白對照組明顯升高(P＜0.05)。
　　結(jié)論:
　　1.宮頸鱗癌組織和CIN組織中LRIG3呈低表達，EG

15、FR高表達，其表達量與宮頸鱗癌的浸潤和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。提示LRIG3通過對EGFR的負反饋調(diào)節(jié)起到抑制宮頸鱗癌發(fā)生發(fā)展的作用。
　　2.LRIG3ASODN能顯著下調(diào)宮頸鱗癌Hela229細胞中LRIG3蛋白和mRNA的表達，同時EGFR蛋白和mRNA表達上升，能抑制宮頸鱗癌細胞凋亡，增強細胞侵襲能力。提示LRIG3在宮頸鱗癌細胞增殖、凋亡及侵襲力中起著重要作用。
　　3.LRIG3ASODN可導致宮頸鱗癌裸鼠成瘤速度加快，體