羧酸酯酶1A2基因多態(tài)性對(duì)氯吡格雷代謝及抗血小板活性影響研究.pdf

1、目的:通過(guò)羧酸酯酶1A2(CES1A2)對(duì)人肝微粒體體系中氯吡格雷體外代謝和中國(guó)健康志愿者口服氯吡格雷的藥代動(dòng)力學(xué)及藥效學(xué)影響的研究,系統(tǒng)探討CES1A2基因多態(tài)性在氯吡格雷代謝和抗血小板活性差異中的作用,以期為臨床氯吡格雷合理使用提供依據(jù)。
　　方法:
　　(1)基因型測(cè)定:用Promega試劑盒提取肝組織和EDTA抗凝的全血中的DNA,用PCR-RFLP法測(cè)定CYP2C19*2/*3基因型,并隨機(jī)抽取樣本率不少于10％用

2、直接測(cè)序?qū)Ψ椒▽W(xué)進(jìn)行驗(yàn)證;用直接測(cè)序法測(cè)定CES1A2 A(-816)C基因型。
　　(2)氯吡格雷及其活性和非活性代謝產(chǎn)物濃度測(cè)定:人肝微粒體孵育體系和人血漿中氯吡格雷及其活性和非活性代謝產(chǎn)物濃度均用超高效液相串聯(lián)質(zhì)譜(UPLC-MS/MS)法測(cè)定。
　　(3)人肝微粒體孵育體系中CES1A2不同基因型下氯吡格雷的體外代謝測(cè)定:根據(jù) CYP2C19*2及*3突變基因的數(shù)目將肝組織分為三種代謝表型:快代謝者[EMs(CYP2

3、C19*1/*1)],中間代謝者[IMs(CYP2C19*1/*2,*1/*3)]和弱代謝者[PMs(CYP2C19*2/*2,*2/*3或*3/*3)]。在根據(jù)CYP2C19分型后的肝組織中,分別隨機(jī)抽取CES1A2不同基因型肝組織(CYP2C19 EM型中CES1A2-816AA,AC和CC各6例;CYP2C19 IM型中AA和AC各6例,未檢出CC型);同種基因型肝組織合并后進(jìn)行氯吡格雷體外代謝試驗(yàn),考察CES1A2催化氯吡咯雷生

4、成非活性代謝產(chǎn)物的酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)特征,同時(shí)測(cè)定CES1A2不同基因型氯吡格雷活性代謝產(chǎn)物生成的情況。利用 Graphpad5.0軟件擬合底物濃度與反應(yīng)速率的非線性回歸方程:單位點(diǎn)的Michaelis-Menten方程,計(jì)算氯吡咯雷非活性代謝產(chǎn)物的體外代謝酶促反應(yīng)的表觀動(dòng)力學(xué)常數(shù)Vmax和Km,求得內(nèi)在清除率Clint(Vmax/Km)。三組基因型肝微粒體中非活性代謝產(chǎn)物生成的酶動(dòng)力學(xué)參數(shù)和活性代謝產(chǎn)物生成水平的比較采用單因素方差分析(A

5、NOVA),三組基因型中的兩兩比較采用LSD(least significant difference)事后檢驗(yàn)或t檢驗(yàn)。P<0.05認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　(4)中國(guó)健康志愿者藥代動(dòng)力學(xué)-藥效學(xué)測(cè)定:11例符合入組標(biāo)準(zhǔn)并簽署知情同意書(shū)的健康志愿者按照 CES1A2不同基因型篩選分成兩組:CYP2C19均為 EM,一組為CES1A2 AA型(n=6例),一組為CES1A2 AC或CC型(n=5例),兩組均給予氯吡格雷300mg后

6、,分別于給藥前(0h)和給藥后0.25,0.5,0.75,1,1.25,1.5,2,3,4,5,6,8,12,24,36h采集血樣,用于藥代動(dòng)力學(xué)(PK)研究;并于給藥前(0h)和給藥后1,2,4,12,24h采集血樣,用于藥效學(xué)(PD)研究。利用UPLC-MS/MS測(cè)定氯吡格雷及其非活性和活性代謝產(chǎn)物的濃度,利用非房室模型分析氯吡格雷原藥、活性及非活性代謝產(chǎn)物藥動(dòng)學(xué)參數(shù);利用四通道血小板聚集儀測(cè)定的ADP誘導(dǎo)的血小板聚集率,以血小板聚

7、集抑制的變化程度(IPA％)作為氯吡格雷藥效學(xué)指標(biāo)。
　　結(jié)果:
　　(1)基因型分布:86例人肝組織樣本中進(jìn)行 CYP2C19*2/*3和 CES1A2 A(-816)C基因測(cè)定:① CES1A2 A(-816)C基因分布:AA型43例(50.0％),AC型37例(41.86％),CC型6例(8.14％);
　?、?CYP2C19*2/*3基因表型分布:快速代謝型EM有37例(43.02％),中等代謝型有38例(44

8、.19％),弱代謝型有11例(12.79％);
　?、蹃喰头植?在37例CYP2C19EM的亞組中:CES1A2 A(-816)C AA型15例(40.54％),AC型16例(43.24％),CC型6例(16.22％);在38例CYP2C19 IM的中,AA型24例(63.16％),AC型14例(36.84％);在11例CYP2C19 PM中, AA型4例(36.36％),AC型7例(63.64％)。
　　(2)人肝微粒體孵

9、育體系與人血漿中氯吡格雷原藥、活性及非活性代謝產(chǎn)物濃度的方法學(xué):氯吡格雷活性代謝產(chǎn)物在肝微粒體孵育體系中和人血漿中的線性范圍均為1~200ng·mL-1,且線性良好(R2分別為0.9977和0.9930);氯吡格雷非活性代謝產(chǎn)物在肝微粒體孵育體系中和人血漿中的線性范圍分別為10~2000ng·mL-1和25~10000ng·mL-1,且線性良好(R2分別為0.9964和0.9945);氯吡格雷原藥在血漿中的線性范圍為0.1~20ng·m

10、L-1,且線性良好(R2為0.9961),方法的批內(nèi)批間精密度、回收率、基質(zhì)效應(yīng)、穩(wěn)定性等均符合生物樣本檢測(cè)要求。
　　(3)CES1A2不同基因型對(duì)人肝微粒體孵育體系中氯吡格雷非活性代謝產(chǎn)物生成酶動(dòng)力學(xué)及活性代謝產(chǎn)物濃度的影響:
　?、?CES1-816CC基因型的Vmax是-816AA型的1.34倍(CC vs AA:635.20±12.06vs475.10±26.55pmol·min-1·mg·protein-1,P<

11、0.05),相應(yīng)的活性代謝產(chǎn)物水平在底物濃度為20、50μM時(shí)呈現(xiàn)出了降低趨勢(shì)(P>0.05)。
　　②根據(jù)CYP2C19代謝表型分組后,在EM組中, CES1-816CC的Vmax是-816AA型的1.39倍(CC vs AA:669.80±20.72vs480.6±13.84pmol·min-1·mg·protein-1, P<0.05),相應(yīng)的氯吡格雷活性代謝產(chǎn)物水平只有-816AA型的60％或更低。在IM中同樣觀察到了類似

12、的現(xiàn)象,但在PM組中,由于活性代謝產(chǎn)物生成量極低,并未觀察到類似的結(jié)果。
　　(4)CES1A2基因多態(tài)性對(duì)健康志愿者氯吡格雷藥代動(dòng)力學(xué)影響:CES1A2-816AA組與CES1A2-816 AC/CC組相比,氯吡格雷AUC0-∞(15.6±4.8 vs9.7±1.7ng·mL-1·h-1),氯吡格雷活性代謝產(chǎn)物AUC0-last、AUC0-∞(122.4±38.1 vs73.9±17.9ng·mL-1·h-1;124.2±37.

13、6vs76.4±17.71ng·mL-1·h-1),顯著升高(P<0.05);CCAM AUC0-last、AUC0-∞和Cmax(41368.46±12832.65 vs64346.12±13740.94ng·mL-1·h-1;42173.30±13382.47 vs65545.46±14166.2ng·mL-1·h-1;11050.06±3308.02vs20671.22±3469.58ng·mL-1)明顯降低(P<0.05)。

14、r>　　(5)CES1A2基因多態(tài)性對(duì)健康志愿者氯吡格雷藥效學(xué)影響:兩組基因型個(gè)體給藥前的血小板聚集率的基礎(chǔ)值均無(wú)差異(P>0.05)。CES1A2-816AA型個(gè)體服藥后2、4h測(cè)定的血小板聚集率變化程度顯著高于-816AC/CC個(gè)體(62.05士7.13％、82.91士6.96％vs47.25士9.44％、61.60士21.51％,P<0.05)。其相應(yīng)的平均效應(yīng)時(shí)間曲線下面積AUEC0-24-816AA型是AC/CC型的1.27倍