β-淀粉樣肽抑制劑的高通量篩選及阿爾茨海默癥β-淀粉樣肽病因?qū)W探究中新藥靶的尋找.pdf

1、第一章β-淀粉樣肽抑制劑的高通量篩選 阿爾茨海默癥(AD)是老年期發(fā)生的以進(jìn)行性癡呆為特征的大腦變性疾病。由于AD形成的機(jī)制不明，現(xiàn)在在臨床上使用或試驗(yàn)的藥品如膽固醇抑制劑，抗炎藥及膽堿酯酶抑制劑等，各針對不同的機(jī)制來治療，最多只能使病情減輕或不再惡化，還沒有可以完全治療的藥物和方法。AD細(xì)胞模型是在體外進(jìn)行誘導(dǎo)，通過模擬AD腦中主要病變而建立的，在藥理學(xué)研究中主要應(yīng)用于尋找防治AD藥物的作用靶位點(diǎn)，建立藥物篩選模型，在細(xì)胞、亞

2、細(xì)胞及分子水平上觀察藥物對病變的防治作用。海馬及皮層與學(xué)習(xí)記憶有關(guān)，也是發(fā)生衰老變化最早部位。AD病理改變主要發(fā)生于海馬和新皮層。因此選用原代培養(yǎng)的海馬及皮層神經(jīng)元作為研究AD的細(xì)胞較為理想。但原代培養(yǎng)神經(jīng)細(xì)胞相對難度大，周期長，所以我們同時(shí)采用具有神經(jīng)細(xì)胞特性，又可穩(wěn)定傳代的人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞株SH-SY5Y用于構(gòu)建β-淀粉樣肽(Aβ)誘導(dǎo)退變的模型，快速篩選β-淀粉樣肽抑制劑。很多證據(jù)表明Aβ是誘導(dǎo)AD發(fā)生的主要病理環(huán)節(jié)，以Aβ誘導(dǎo)

3、的SH-SY5Y細(xì)胞株退行性病變是老年性癡呆疾病的一個(gè)較貼近的模型。我們實(shí)驗(yàn)中建立了Aβ誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞株退行性病變模型用于高通量篩選Aβ抑制劑。 第二章Aβ誘導(dǎo)體外培養(yǎng)的皮層神經(jīng)元退行性病變的基因表達(dá)譜分析 淀粉樣蛋白Aβ在腦內(nèi)的累積，是AD疾病的重要發(fā)病機(jī)制之一，但是對于Aβ如何發(fā)揮其毒性，還缺乏足夠深入的了解。AD是多基因聯(lián)合調(diào)控的與衰老有關(guān)的神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病。雖然它的主要病理特征已經(jīng)明確，但是涉及其病理

4、過程的基因及其表達(dá)水平尚不確定。尤其與老年斑和神經(jīng)元纖維纏積有關(guān)的主要成分來源于APP和Tau蛋白，它們本身都是正常機(jī)體的組成成分，具有一系列正常生理作用，導(dǎo)致其成為病理產(chǎn)物的因素則值得更加關(guān)注。在腦內(nèi)Aβ的慢性累積過程中究竟發(fā)生了哪些分子水平的變化，通過對芯片結(jié)果的分析，顯示Aβ誘導(dǎo)神經(jīng)元退行性變化可以在多條通路上起作用，正如AD疾病研究中發(fā)現(xiàn)的在AD病理過程中涉及到多種病理變化，包括內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、膽堿能神經(jīng)退變、自由基損傷、鈣穩(wěn)態(tài)失衡

5、、細(xì)胞凋亡、免疫炎癥、線粒體機(jī)能障礙以及神經(jīng)肽變化等，我們芯片的結(jié)果也顯示Aβ在體外培養(yǎng)的神經(jīng)元作用幾乎能引起上述所有的病理生理改變，這從分子角度很好地證實(shí)了AD病因?qū)W發(fā)生的Aβ級聯(lián)假說，同時(shí)也給我們進(jìn)一步研究AD提供了良好的基因靶標(biāo)。 對差異表達(dá)的功能基因進(jìn)行分析，芯片結(jié)果顯示Aβ作用能直接降低神經(jīng)元抗應(yīng)激能力。Aβ使熱休克蛋白表達(dá)普遍下調(diào)，提示AD發(fā)病過程中Aβ累積增多，使神經(jīng)元抗應(yīng)激能力下降，在不利環(huán)境下，細(xì)胞缺乏自身的保

6、護(hù)功能，容易誘導(dǎo)應(yīng)激細(xì)胞壞死或凋亡發(fā)生。芯片的研究顯示Aβ下調(diào)谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-PO)、CD36、白細(xì)胞介素-12P40前體蛋白表達(dá)等，減弱了神經(jīng)元的抗應(yīng)激能力。Aβ上調(diào)一氧化氮合酶表達(dá)，一氧化氮生成增多，使氧化壓力上升。Aβ通過抑制炎癥通路上相關(guān)蛋白的表達(dá)也使應(yīng)激細(xì)胞生成熱休克蛋白、抗氧化酶類、免疫物質(zhì)等下降，加劇了細(xì)胞損傷的發(fā)生。 GABAA介導(dǎo)的抑制效應(yīng)可能是引起AD精神病理癥狀的重要原因。在我們的研究中發(fā)現(xiàn)Aβ

7、能使3一羥基3一甲基戊二酰輔酶A還原酶表達(dá)上調(diào)，Aβ上調(diào)該酶的表達(dá)導(dǎo)致膽固醇合成增多很可能在AD發(fā)病過程中起到重要的作用。但顯然單純的膽固醇合成增多還不至于引發(fā)AD，膽固醇在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的進(jìn)一步代謝很可能與AD發(fā)病有關(guān)。Aβ使GABAA受體pi亞基表達(dá)大幅上調(diào)，GABAA受體的pi亞基能與其它亞基結(jié)合改變受體對體內(nèi)內(nèi)源性類固醇物質(zhì)的敏感性。我們推測Aβ誘導(dǎo)神經(jīng)元膽固醇合成增加，改變神經(jīng)類固醇物質(zhì)的代謝活動，持續(xù)增強(qiáng)GABAA介導(dǎo)的抑制效

8、應(yīng)，是引起AD精神病理癥狀的關(guān)鍵原因。 Aβ使卵泡抑制素上調(diào)(follistatingene，exon6，clonespROF上調(diào)1.69倍，follistatin上調(diào)1.75倍)、oxcytocin(Oxt)上調(diào)1.52倍、生長抑素Somatostatin(Sst)下調(diào)1.52倍。Aβ上調(diào)卵泡抑制素表達(dá)可能直接導(dǎo)致雌性激素水平下降，性激素替代療法在一定程度預(yù)防AD的發(fā)生和發(fā)展，也說明神經(jīng)激素水平紊亂參與了AD的發(fā)病過程。干擾或

9、抑制卵泡抑制素的表達(dá)很可能對預(yù)防或治療AD有一定的作用。 Aβ增強(qiáng)PDE3B活性，上調(diào)其蛋白表達(dá)，可能與腦內(nèi)脂質(zhì)合成增加有關(guān)。而Myomegalin與PDE3B相互作用形成一種巨分子的復(fù)合物，錨定在細(xì)胞膜和各種細(xì)胞器質(zhì)膜起作用。 副凋亡(Para-apoptosis)參與Aβ誘導(dǎo)的細(xì)胞程序性死亡。副凋亡是一種不同于凋亡的程序性細(xì)胞死亡方式。芯片結(jié)果顯示Aβ下調(diào)P物質(zhì)及其受體的表達(dá)，提示Aβ誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞程序性死亡過程中發(fā)

10、生了神經(jīng)肽P物質(zhì)介導(dǎo)的副凋亡現(xiàn)象。Aβ使凋亡相關(guān)的Caspase-3、Nedd4及BCL2家族BH3作用區(qū)域凋亡激動劑Bid3基因表達(dá)下調(diào)。這表明Aβ可能并不能直接激活細(xì)胞的線粒體凋亡通路，相反在早期對凋亡的神經(jīng)元有一定的保護(hù)作用。在AD病理晚期，據(jù)報(bào)道有較多的神經(jīng)元凋亡發(fā)生，但一旦半胱天冬酶執(zhí)行程序處于適當(dāng)位置，對下游如半胱天冬酶激活作用的干擾，其抑制作用恐怕不足以終止退行性病變過程，充其量只能延緩細(xì)胞凋亡，對治療AD難以取得好的效果

11、。 Aβ誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)部的“交通阻塞”，可能是阿爾茨海默氏癥的早期預(yù)兆。在我們實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)Aβ能誘導(dǎo)神經(jīng)元microtubule-associatedproteintau(Mapt)和serine/threonineproteinkinaseTAO2(Tao2)表達(dá)上調(diào)，可能與Tau蛋白在腦神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)異常聚集形成神經(jīng)纖維纏積(NFT)有關(guān)。Aβ能下調(diào)突觸后膜的PSD-95bindingprotein、vesicle-associa

12、tedmembraneprotein2(Vamp2)以及突觸前膜的突觸融合蛋白syntaxin5a(Stx5a)0.4713(后膜)表達(dá)。在我們的實(shí)驗(yàn)中還顯示ADP-ribosylationfactor-like1(Arl1)、ADP-ribosylationfactor4(Arf4)、ADP-ribosylargininehydrolase全部下調(diào)，可能與細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)抑制有重要的關(guān)系。Lysosomalaminoacidtransp

13、orter1、Atp6b2、鈣網(wǎng)蛋白CRT、分泌顆粒素Scg2及轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族Slc12a1等基因表達(dá)改變也提示Aβ水平提高會影響受體蛋白的運(yùn)輸，Aβ很可能通過調(diào)節(jié)內(nèi)涵體輸送通路影響細(xì)胞表面受體的分布和作用。 第三章轉(zhuǎn)染衰老標(biāo)志性鈣結(jié)合蛋白Rgn及神經(jīng)激肽B受體Tacr3對Aβ1-42誘導(dǎo)PC12細(xì)胞退行性病變的保護(hù)作用 我們在用基因芯片技術(shù)研究Aβ誘導(dǎo)體外培養(yǎng)的皮層神經(jīng)元退行性病變的基因表達(dá)譜改變時(shí)發(fā)現(xiàn)Aβ下調(diào)衰老標(biāo)志性

14、鈣結(jié)合蛋白Regucalcin(Rgn)及神經(jīng)激肽B受體tachykininreceptor3(Tacr3)的表達(dá)。我們利用大鼠的cDNA以PCR方法擴(kuò)增Rgn及Tacr3基因片段，插入pIRESneo2真核表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染PC12細(xì)胞，來觀察該基因在Aβ1-42引發(fā)AD發(fā)生的過程中可能起到的作用。 由于在實(shí)驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)，我們購買的高度分化的PC12細(xì)胞在濃度高達(dá)2000μg/ml的G418中仍具有抗性，給篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞

15、株帶來了困難。所以我們利用重組的pIRES-EGFP2載體觀察載體在PC12細(xì)胞中的表達(dá)和轉(zhuǎn)染效率，我們的結(jié)果顯示重組的pIRES-EGFP2轉(zhuǎn)染后48小時(shí)綠色熒光蛋白在PC12細(xì)胞中有很高的表達(dá)。推測重組的pIRESneo2-Rgn及pIRESneo2-Tacr3在PC12細(xì)胞中也能獲得高表達(dá)，另外瞬時(shí)轉(zhuǎn)染表達(dá)Rgn及Tacr3對PC12細(xì)胞存活率影響結(jié)果顯示Rgn轉(zhuǎn)染對照組，Tacr3轉(zhuǎn)染對照組及空載體轉(zhuǎn)染對照組細(xì)胞存活率沒有顯著性

16、差異。因此我們采用了較為簡便的瞬時(shí)轉(zhuǎn)染來研究Rgn及Tacr3的功能。 瞬時(shí)轉(zhuǎn)染表達(dá)Rgn及Tacr3對Aβ1-42誘導(dǎo)PC12細(xì)胞存活率的影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示經(jīng)20μMAβ1-42處理后，細(xì)胞增殖及存活能力下降，其中野生型Aβ1-42組細(xì)胞存活率下降至58.5％，空載體轉(zhuǎn)染Aβ1-42組細(xì)胞存活率為64.9％，兩者對Aβ1-42誘導(dǎo)的反應(yīng)沒有顯著性差異。瞬時(shí)轉(zhuǎn)染表達(dá)Rgn及Tacr3能部分拮抗Aβ1-42的作用。結(jié)果顯示Rgn轉(zhuǎn)染

17、Aβ1-42組細(xì)胞存活率上升至71.8％，對比空載體轉(zhuǎn)染Aβ1-42組上升了6.9％，兩者有顯著性差異。Tacr3轉(zhuǎn)染Aβ1-42組細(xì)胞存活率上升至83.8％，對比空載體轉(zhuǎn)染Aβ1-42組上升了18.9％，兩者也有顯著性差異。經(jīng)10μMAβ1-42處理后，野生型Aβ1-42組細(xì)胞存活率下降至68.2％，空載體轉(zhuǎn)染Aβ1-42組細(xì)胞存活率為70.9％，兩者對Aβ1-42誘導(dǎo)的反應(yīng)沒有顯著性差異。結(jié)果顯示瞬時(shí)轉(zhuǎn)染表達(dá)Rgn及Tacr3能部分