β淀粉樣前體蛋白羧基端肽(APPC31)在阿爾茨海默病中致病作用的實驗研究.pdf

1、目的：體外探討β淀粉樣前體蛋白羧基端肽（APPC31）在阿爾茨海默?。ˋzleimer’s disease, AD）中的毒性作用及機制，為進一步探討AD的發(fā)病機制和治療方法提供理論基礎和實驗依據(jù)。
　　 方法：采用分子克隆實驗方法構(gòu)建pIRES2-EGFP-APPC31 、pEGFP-C2-APP△C31 真核過表達質(zhì)粒。采用脂質(zhì)體法分別將過表達的空載體質(zhì)粒、野生型APP695 質(zhì)粒、APP（D664A）質(zhì)粒、APP 氨基端長肽

2、(APP△C31)質(zhì)粒和APPC31 質(zhì)粒瞬時轉(zhuǎn)染Neuro2a 細胞。采用細胞免疫熒光方法驗證質(zhì)粒成功轉(zhuǎn)入細胞并表達目的蛋白。采用四甲基偶氮唑鹽（MTT）比色法觀察質(zhì)粒APPC31 轉(zhuǎn)染入Neuro2a 細胞48h 后的細胞活力,和不同濃度的β淀粉樣蛋白（Aβ42）作用24h 后的Neuro2a 細胞活力，以及轉(zhuǎn)染各組質(zhì)粒24h 后與Aβ42(10μM)共孵育24h 的Neuro2a 細胞活力。通過DAPI 核染色觀察細胞核形態(tài)，與空

3、載體轉(zhuǎn)染細胞組對照，觀察Aβ42 處理下APPC31 的致細胞毒性作用。通過Western blotting 方法，檢測Aβ42（10μM）作用Neuro2a 后Tau 蛋白磷酸化水平，及質(zhì)粒APPC31轉(zhuǎn)染入Neuro2a 細胞36h 后和瞬時轉(zhuǎn)染各組質(zhì)粒后24h 與Aβ42共孵育12h時的Tau 蛋白磷酸化水平變化。用GSK3β抑制劑LiCl 分別處理轉(zhuǎn)染野生型APP695 質(zhì)粒及APPC31 質(zhì)粒的細胞，與Aβ42(10μM)共孵

4、育12h 后，采用Western blotting 方法檢測其Tau 蛋白磷酸化水平的變化。
　　 結(jié)果：在未與Aβ42 共孵育時，空載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組和APPC31 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組Neuro2a 細胞的活力無明顯差異（P>0.05）；在Aβ42（10μM）共孵育條件下，無轉(zhuǎn)染組、空載體質(zhì)粒組、野生型APP695 質(zhì)粒組、APP（D664A）質(zhì)粒組和APPC31 質(zhì)粒組Neuro2a 細胞活力與空載體質(zhì)粒組對比，野生型APP695 質(zhì)粒

5、組及APPC31 質(zhì)粒組細胞活力明顯下降（P<0.05）,且細胞核呈現(xiàn)明顯濃縮、染色加深改變。Aβ42 所致Tau 蛋白在Ser396、199 位點的磷酸化呈時間依賴性,在12h 時磷酸化水平最高；
　　 Aβ42 致APP、APPC31 過表達細胞中Tau 蛋白在Ser396 位點的磷酸化水平顯著升高(P<0.05）同時這種磷酸化水平被GSK-3β抑制劑LiCl 顯著抑制（P<0.05），提示在野生型APP 及APPC31 過

6、表達的Neuro2a 細胞中，GSK-3β參與了APPC31 增強的Tau 蛋白在Ser396 位點磷酸化水平的升高。
　　 結(jié)論：體外Neuro2a 細胞研究中，單獨過表達一定水平的APPC31并不具有細胞毒性；但此短肽可增強Aβ42 的致細胞毒性作用。且此短肽可通過增強GSK-3β誘導的Tau 蛋白在Ser396 位點磷酸化水平來增強Aβ42 的細胞毒性作用。為進一步明確其發(fā)病機制提供了一定的理論基礎和實驗依據(jù)。