乙型腦炎病毒強(qiáng)弱毒毒力差異的分子機(jī)制研究.pdf

1、乙型腦炎病毒(Japanese encephalitis virus, JEV)是黃病毒科黃病毒屬成員，通過侵害中樞神經(jīng)系統(tǒng)引發(fā)人和豬、馬、野生水禽等動(dòng)物的病毒性腦炎，危害嚴(yán)重。因JEV具有神經(jīng)毒力，對減毒活疫苗的安全性擔(dān)憂使其仍不能被廣泛接受。尋找JEV基因組中的毒力位點(diǎn)并探索其減毒機(jī)制是進(jìn)一步研究JEV致病機(jī)理、研制安全有效的新型疫苗的關(guān)鍵。本研究以具有強(qiáng)神經(jīng)毒力的JEV HEN0701株及其細(xì)胞傳代致弱株HEN-10S3為研究對象

2、，利用反向遺傳操作技術(shù)，探索導(dǎo)致JEV毒力差異的分子基礎(chǔ)及毒力增強(qiáng)或減弱的分子機(jī)制。
　　JEV反向遺傳操作系統(tǒng)的建立因其cDNA克隆在宿主菌中所具有的“遺傳不穩(wěn)定性”而受到阻礙。為了建立穩(wěn)定的JEV全長感染性cDNA克隆，我們以HEN0701株基因組中極易發(fā)生突變的5’端序列區(qū)段(nt1-2913)為研究對象，利用軟件尋找影響病毒cDNA穩(wěn)定性的相關(guān)序列，驗(yàn)證該序列對病毒cDNA克隆穩(wěn)定性的影響，并對其進(jìn)行定點(diǎn)突變和原核啟動(dòng)子活

3、性的測定。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，JEV基因組nt54-120較高的原核啟動(dòng)子活性和JEV結(jié)構(gòu)基因在宿主菌中的表達(dá)共同導(dǎo)致了JEV cDNA克隆在E.coli中難以穩(wěn)定增殖。于基因組nt1275與nt1600之間截?cái)郋基因可以穩(wěn)定cDNA克隆。于nt90做A-C突變雖可降低原核啟動(dòng)子活性，但不能穩(wěn)定克隆。室溫(25 ℃)培養(yǎng)轉(zhuǎn)化菌，nt54-120的原核啟動(dòng)子活性有效降低，明顯提高了2913-nt cDNA克隆在宿主菌中的遺傳穩(wěn)定性。因此，低溫培養(yǎng)轉(zhuǎn)

4、化菌是提高黃病毒cDNA克隆在宿主菌中遺傳穩(wěn)定性的有效方法。
　　以低溫培養(yǎng)轉(zhuǎn)化菌為基本前提，我們將HEN-10S3基因組全長分為相互重疊的四段，并在第一段5’端加上NotI酶切位點(diǎn)和T7啟動(dòng)子序列，在第四段3’末端加上HDV核酶序列和XhoI酶切位點(diǎn)。利用四條片段重疊序列以及 pBR322M載體序列中合適的酶切位點(diǎn)，將四條片段于pBR322M中依次拼接成全長cDNA，構(gòu)建HEN-10S3全長cDNA克隆pBAHC。經(jīng)過體外轉(zhuǎn)錄并

5、轉(zhuǎn)染 BHK-21細(xì)胞，獲得拯救病毒 vAHEN。經(jīng)鑒定，拯救病毒與親本毒在體外生長特性和對小鼠神經(jīng)毒力兩方面都具有相似特性?？寺BAHC具有較好的穩(wěn)定性且易于操作，連同本實(shí)驗(yàn)早期構(gòu)建的HEN0701感染性克隆pJEHEN，為進(jìn)一步深入研究JEV毒力差異提供了關(guān)鍵的技術(shù)平臺(tái)。
　　以HEN0701和HEN-10S3全長感染性cDNA克隆為基礎(chǔ)，將兩病毒5’-UTR和結(jié)構(gòu)蛋白編碼區(qū)序列（5’UTR-C-PrM-E）互換。分別構(gòu)建了

6、以HEN0701基因組為骨架嵌合克隆JE-H/5’-CPrME(S)和以 HEN-10S3基因組為骨架的嵌合克隆 JE-S/5’-CPrME(H)，并拯救出嵌合病毒vJE-H/5’-CPrME(S)和 vJE-S/5’-CPrME(H)。對3w小鼠的毒力測試結(jié)果顯示，與親本毒相比，嵌合病毒神經(jīng)毒力發(fā)生顯著變化。vJE-S/5’CPrME(H)毒力明顯上升，表現(xiàn)出強(qiáng)毒特性；而vJE-H/5’CPrME(S)毒力顯著下降，表現(xiàn)出弱毒特性。說

7、明所替換序列對病毒毒力存在重要影響。由于在該序列中僅存在E蛋白第138位氨基酸(E-138 Glu/Arg)一個(gè)位點(diǎn)的差異，說明E-138位點(diǎn)可能是影響病毒神經(jīng)毒力的關(guān)鍵位點(diǎn)。
　　利用PCR定點(diǎn)突變技術(shù)，將HEN0701 E-138 Glu(E)分別突變?yōu)樗嵝园被酇sp(D)，堿性氨基酸Arg(R)和Lys(K)及中性氨基酸Phe(F)、Ala(A)和Gln(Q)。將HEN-10S3 E-138 R突變成E-138 E。并拯救

8、突變病毒vHE138D、vHE138R、vHE138K、vHE138F、vHE138A、vHE138Q和vSE138E。突變病毒對3w小鼠的毒力測試結(jié)果顯示，vHE138D和vSE138E具有強(qiáng)神經(jīng)毒力；vHE138R和vHE138K無神經(jīng)毒力；vHE138F、vHE138A和vHE138Q具有一定的神經(jīng)毒力，介于之間。說明E-138確實(shí)是影響JEV神經(jīng)毒力的關(guān)鍵位點(diǎn)，且毒力的強(qiáng)弱與該位點(diǎn)的酸堿性質(zhì)有關(guān)。
　　利用生物信息學(xué)軟件分

9、析HEN0701 E蛋白結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)E蛋白E-138與E-47位氨基酸在空間結(jié)構(gòu)上相鄰，以氫鍵相連，但連接方式隨毒力不同而不同。為了研究 E-47對病毒毒力的影響及其與E-138之間的關(guān)系，將HEN0701 E-47位Asn(N)分別突變?yōu)樗嵝园被酇sp(D)、堿性氨基酸Lys(K)和中性氨基酸Ala(A)，拯救出突變病毒vHE47D、vHE47K和vHE47A。其對小鼠的毒力測試結(jié)果顯示，vHE47D具有強(qiáng)神經(jīng)毒力；vHE47K無神經(jīng)

10、毒力；vHE47A神經(jīng)毒力介于之間。說明JEV E蛋白第47位氨基酸是能夠影響病毒神經(jīng)毒力的潛在毒力位點(diǎn)，且病毒毒力與該位點(diǎn)氨基酸的酸堿性質(zhì)有關(guān)。根據(jù)本研究中所構(gòu)建的14種重組病毒毒力差異與兩位突變位點(diǎn)酸堿性質(zhì)之間的關(guān)系，發(fā)現(xiàn) E-47與E-138位氨基酸的酸堿性質(zhì)共同決定了病毒的神經(jīng)毒力，酸性越強(qiáng)則毒力越強(qiáng)，當(dāng)兩個(gè)位點(diǎn)同時(shí)為酸性氨基酸時(shí)，病毒毒力最強(qiáng)。
　　綜上所述，本研究通過一系列試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在低溫培養(yǎng)轉(zhuǎn)化菌可以有效提高黃病毒cD