乙型腦炎病毒入侵神經(jīng)細(xì)胞的內(nèi)吞機(jī)制研究.pdf

1、乙型腦炎病毒又稱日本腦炎病毒(Japanese encephalitis virus，JEV)，屬于黃病毒科（Flaviviridae）黃病毒屬（Flavivirus），為有包膜的單正鏈RNA病毒。JEV為流行性乙型腦炎的病原體，主要以蚊蟲(chóng)為媒介進(jìn)行傳播，感染后引發(fā)嚴(yán)重的急性神經(jīng)系統(tǒng)癥狀，對(duì)人類(lèi)健康威脅巨大。乙型腦炎主要流行于東亞、東南亞地區(qū)，近年來(lái)其發(fā)病率有明顯上升的趨勢(shì)，可見(jiàn)JEV感染仍然是嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問(wèn)題，因而對(duì)JEV致病機(jī)理和

2、預(yù)防手段的研究已成為亟待解決的前沿課題。
　　 病毒感染宿主細(xì)胞必須經(jīng)過(guò)吸附、穿入細(xì)胞內(nèi)、脫殼、生物合成、病毒顆粒的裝配、釋放這樣一個(gè)完整的復(fù)制周期，這實(shí)際上是病毒與宿主細(xì)胞相互作用的過(guò)程。為了有效感染宿主細(xì)胞，病毒必須先要穿入細(xì)胞內(nèi)到達(dá)特定區(qū)域才能啟動(dòng)并完成自我復(fù)制。大多數(shù)包膜病毒與靶細(xì)胞結(jié)合以后利用細(xì)胞內(nèi)吞方式作為穿入宿主細(xì)胞的途徑，這些內(nèi)吞途徑包括:網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞(Clathrin-mediated endocytos

3、is)、膜穴樣凹陷介導(dǎo)的內(nèi)吞(Caveola-mediated endocytosis)、巨胞飲作用(Macropinocytosis)和網(wǎng)格蛋白、膜穴樣凹陷非依賴型內(nèi)吞(Clathrin-and Caveola-independent endocytosis)等。黃病毒屬病毒入胞途徑多樣且復(fù)雜，甚至同一種病毒的不同亞型入侵同一種細(xì)胞的內(nèi)吞機(jī)制也不相同;然而，關(guān)于JEV如何利用宿主細(xì)胞固有運(yùn)輸元件完成病毒內(nèi)吞，及其精確的調(diào)控機(jī)制未見(jiàn)報(bào)道

4、。
　　 本課題以大鼠神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞（B104細(xì)胞）為研究對(duì)象，針對(duì)JEV（疫苗株SA14-14-2株）的入胞過(guò)程，通過(guò)化學(xué)抑制劑阻斷、細(xì)胞內(nèi)過(guò)表達(dá)顯性抑制突變體以及RNA干擾(RNAi)等方法，系統(tǒng)分析了JEV利用何種宿主細(xì)胞元件，通過(guò)何種內(nèi)化途徑侵入神經(jīng)細(xì)胞。本研究首先建立了JEV感染的神經(jīng)細(xì)胞模型，并通過(guò)病毒動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)，分析JEV入侵B104細(xì)胞的內(nèi)化速率及動(dòng)力學(xué)特征。然后，選用針對(duì)不同細(xì)胞內(nèi)吞途徑的化學(xué)抑制劑分別阻斷各

5、條內(nèi)吞途徑，包括網(wǎng)格蛋白依賴的途徑、膜穴樣凹陷依賴的途徑、發(fā)動(dòng)蛋白(Dynamin)依賴的途徑、膽固醇(Cholesterol)依賴的途徑、以及低pH依賴的途徑等，觀察上述處理對(duì)JEV和單周期JEV假病毒(JEVpv)入侵神經(jīng)細(xì)胞的影響。繼而，通過(guò)外源轉(zhuǎn)染特異性的顯性抑制突變體或小干擾RNA，破壞各內(nèi)吞途徑的關(guān)鍵分子，進(jìn)一步分析和確認(rèn)JEV入侵所依賴的內(nèi)吞途徑。在以上研究基礎(chǔ)上，通過(guò)化學(xué)抑制劑阻斷法，觀察JEV不同基因型病毒株入侵B10

6、4細(xì)胞的內(nèi)吞途徑是否存在株特異性;同時(shí)，采用化學(xué)抑制劑阻斷法比較分析JEV入侵神經(jīng)細(xì)胞和非神經(jīng)細(xì)胞的內(nèi)吞途徑的異同。
　　 本研究的主要結(jié)果和結(jié)論如下:
　　 1.JEV入侵大鼠神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞不依賴網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞途徑
　　 通過(guò)網(wǎng)格蛋白抑制劑Chlorpromazine、細(xì)胞內(nèi)過(guò)表達(dá)EPS15蛋白顯性抑制突變體以及下調(diào)網(wǎng)格蛋白表達(dá)等方法，可阻斷網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞途徑;然而上述處理并不影響JEV和JEVpv的

7、入侵，提示JEV入侵B104細(xì)胞不通過(guò)網(wǎng)格蛋白依賴型內(nèi)吞途徑。
　　 2.JEV入侵大鼠神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞依賴發(fā)動(dòng)蛋白
　　 利用發(fā)動(dòng)蛋白抑制劑Dynasore、外源轉(zhuǎn)染DynaminⅡ K44A顯性抑制突變體或針對(duì)Dynamin的特異性小干擾RNA，能夠破壞發(fā)動(dòng)蛋白的功能，并明顯抑制了JEV和JEVpv的內(nèi)吞，表明JEV入侵B104細(xì)胞依賴發(fā)動(dòng)蛋白的作用。
　　 3.JEV通過(guò)膜穴樣凹陷(Caveola)介導(dǎo)的內(nèi)

8、吞途徑入侵大鼠神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞
　　 當(dāng)B104細(xì)胞與膽固醇抑制劑MβCD和Filipin作用后，細(xì)胞膜膽固醇及Caveola的結(jié)構(gòu)完整性被破壞。這兩種抑制劑能夠明顯的抑制JEV和JEVpv的入侵，提示JEV的入侵依賴膽固醇和Caveola。在靶細(xì)胞內(nèi)過(guò)表達(dá)Caveolin-1顯性抑制突變體或下調(diào)Caveolin-1的表達(dá)，可阻斷Caveola介導(dǎo)內(nèi)吞的功能，并顯著抑制了JEV的入侵能力。此外，采用化學(xué)抑制劑Genistein抑

9、制Caveola內(nèi)吞途徑的信號(hào)通路，也能夠明顯地抑制JEVpv的內(nèi)吞。為了更直觀的檢測(cè)JEV的內(nèi)吞途徑，我們通過(guò)免疫熒光法標(biāo)記Caveola依賴型內(nèi)吞途徑標(biāo)志分子霍亂毒素B(CTB)以及Caveolin-1，并觀察在病毒內(nèi)吞過(guò)程中它們與JEV病毒顆粒的分布情況。激光共聚焦結(jié)果顯示，絕大多數(shù)JEV病毒顆粒與胞內(nèi)CTB以及Caveolin-1分子共定位。以上結(jié)果表明JEV通過(guò)膜穴樣凹陷(Caveola)介導(dǎo)的內(nèi)吞途徑入侵B104細(xì)胞。

10、>　　 4.JEV入侵大鼠神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞不依賴細(xì)胞巨胞飲作用
　　 通過(guò)EIPA或Wortmannin阻斷細(xì)胞的巨胞飲途徑，或干擾PI3K表達(dá)以抑制巨胞飲依賴的信號(hào)通路，均不能抑制JEV和JEVpv的入侵，提示JEV入侵不依賴細(xì)胞巨胞飲作用。
　　 5.JEV入侵大鼠神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞依賴酸性pH環(huán)境
　　 利用內(nèi)體酸化抑制劑Chloroquine和Ammonium Chloride來(lái)提升內(nèi)體pH能夠明顯抑制J

11、EV的入侵。在維持內(nèi)體低pH環(huán)境中發(fā)揮質(zhì)子泵作用的VATPase被下調(diào)后，JEVpv的感染能力也受到顯著抑制，提示JEV入侵依賴內(nèi)體酸性pH環(huán)境。
　　 6.JEV入侵大鼠神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的內(nèi)吞途徑不存在株特異性
　　 采用不同化學(xué)抑制劑阻斷各條內(nèi)吞途徑，分析對(duì)JEV基因Ⅲ型病毒株SA14和基因Ⅰ型病毒株SH-53入侵的影響。我們發(fā)現(xiàn)，這兩種基因型的JEV病毒株與疫苗株SA14-14-2株的入侵方式相同，均通過(guò)Caveo

12、la介導(dǎo)的、發(fā)動(dòng)蛋白和pH依賴型的內(nèi)吞途徑入胞，表明JEV入侵B104細(xì)胞所依賴的內(nèi)吞途徑不存在株特異性。
　　 7.JEV入侵非神經(jīng)類(lèi)細(xì)胞不同于入侵大鼠神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞所依賴的內(nèi)吞途徑
　　 分別將針對(duì)不同內(nèi)吞途徑的化學(xué)抑制劑作用于B104、Vero、CHO和Huh7細(xì)胞分析對(duì)JEV入侵的影響。結(jié)果顯示，JEV通過(guò)網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞途徑入侵Vero，CHO和Huh7細(xì)胞;而入侵B104細(xì)胞則通過(guò)Caveola介導(dǎo)的內(nèi)吞

13、途徑，提示JEV入侵神經(jīng)類(lèi)細(xì)胞所依賴的內(nèi)吞途徑不同于其它非神經(jīng)細(xì)胞。
　　 綜上所述，本研究系統(tǒng)分析了JEV入侵大鼠神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的內(nèi)吞途徑及作用機(jī)制，證明JEV入侵B104細(xì)胞是通過(guò)膜穴樣凹陷(Caveola)介導(dǎo)的，發(fā)動(dòng)蛋白和pH依賴型的內(nèi)吞途徑。這種內(nèi)吞途徑有別于JEV感染非神經(jīng)細(xì)胞的入侵方式，也與其它黃病毒屬成員的內(nèi)吞機(jī)制不同，可能與JEV的神經(jīng)嗜性和致病性相關(guān)。闡明JEV入侵神經(jīng)細(xì)胞過(guò)程中所利用的固有元件，以及精確的