應(yīng)用siRNAs抑制乙型腦炎病毒復(fù)制及乙型腦炎“自殺性”DNA疫苗研究.pdf

1、乙型腦炎(JE)(簡(jiǎn)稱(chēng)乙腦)，是由乙型腦炎病毒(JEV)引起的一種嚴(yán)重危害人畜健康的蟲(chóng)媒病毒性疾病。該病對(duì)人類(lèi)危害巨大，約三分之一的患者會(huì)死亡，存活的患者中有40％-70％會(huì)留下神經(jīng)后遺癥。乙腦也是危害養(yǎng)豬業(yè)的重大疫病之一，該病感染豬造成的主要經(jīng)濟(jì)損失是導(dǎo)致嚴(yán)重的繁殖障礙性疾病。目前對(duì)于該病還沒(méi)有有效的治療方法。RNAi是機(jī)體本身存在的天然抗病毒機(jī)制，為人們預(yù)防和治療病毒感染開(kāi)啟了希望之門(mén)。本實(shí)驗(yàn)利用RNAi技術(shù)，從抑制病毒復(fù)制的角度，

2、為乙腦的免疫預(yù)防丌辟新途徑。同時(shí)，本研究還開(kāi)展了乙腦病毒主要免疫原性基因E和NSl的“自殺性”DNA疫苗研究，并在此基礎(chǔ)上探討了牛皰疹病毒I型(BHV-1)的VP22蛋白對(duì)乙腦病毒“自殺性”DNA疫苗免疫效果的影響。主要研究?jī)?nèi)容如下： 1．siRNAs對(duì)乙腦病毒NSl基因表達(dá)的抑制 以乙腦病毒的NSl基因?yàn)榘谢?，設(shè)計(jì)合成了4個(gè)siRNA序列，并構(gòu)建了各自的表達(dá)質(zhì)粒(pS-NSlA，pS-NSlB，pS-NSlC，pS-

3、NSlD)；構(gòu)建了NSl基因與EGFP融合的真核表達(dá)質(zhì)粒(pCDNSl-EGFP)，并實(shí)現(xiàn)了二者在Vero細(xì)胞和BHK-21細(xì)胞中的融合表達(dá)；將siRNA表達(dá)質(zhì)粒與pCDNSl-EGFP共轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，經(jīng)熒光觀察、流式細(xì)胞儀檢測(cè)、Western blot、RT-PCR等方法證實(shí)：在4個(gè)siRNAs序列中，pS-NSlA的抑制作用不明顯，而pS-NSlB、pS-NSlC、pS-NSlD對(duì)NSl基因表達(dá)有顯著的特異性抑制作用，其中pS-NSl

4、C和pS-NSlD抑制效果達(dá)到80％-90％。 2．siRNAs對(duì)乙腦病毒復(fù)制的抑制 將上述構(gòu)建的4個(gè)siRNAs表達(dá)質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染BHK-21細(xì)胞，24小時(shí)后感染130PFU乙腦病毒，經(jīng)間接免疫熒光觀察、Western blot、空斑形成實(shí)驗(yàn)、RT-PCR等方法證實(shí)：在4個(gè)siRNAs序列中，pS-NSlA的抑制作用不明顯，pS-NSlB，pS-NSlC，pS-NSlD對(duì)乙腦病毒復(fù)制有顯著的特異性抑制作用，其中pS-NS

5、lC，pS-NSlD抑制效果達(dá)到79％-86％。 3．乙腦病毒E、NS1基因“自殺性”DNA疫苗與常規(guī)DNA疫苗的免疫效果比較 將乙腦病毒E和NSl基因分別插入到“自殺性”DNA疫苗載體—PSCAI(pS)，分別構(gòu)建了pSNSl、pSE兩種“自殺性”DNA疫苗。在此基礎(chǔ)上，將BHV-1的VP22蛋白基因分別插入到NSl、E基因的上游，使VP22與NSl、E基因融合表達(dá)，從而構(gòu)建了另兩種“自殺性”DNA疫苗：pSBNSl、