豬水皰病病毒衣殼蛋白基因自殺性DNA疫苗研究.pdf

1、本研究為了研究豬水皰病病毒(SVDvirus，SVDV)衣殼蛋白基因自殺性DNA疫苗的免疫原性和保護效力，評價自殺性DNA疫苗從分子水平上防制SVD的潛在應(yīng)用價值，克隆了SVDVHK'70株衣殼蛋白基因1BCD，并進行了測序。應(yīng)用生物信息學(xué)技術(shù)，研究了該基因的特征，預(yù)測了農(nóng)殼蛋白的B細胞表位。利用基因重組技術(shù)，構(gòu)建了包含SVDV1BCD基因的重組復(fù)制子載體pSCA/1BCD，借助脂質(zhì)體將純化的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染BHK-21細胞，通過RT-PC

2、R法、間接免疫熒光法(IFA)和酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)檢測外源基因在細胞中的表達情況和表達蛋白的活性。為評價重組質(zhì)粒作為DNA疫苗對實驗動物及本動物的免疫效果，通過肌肉注射免疫豚鼠利豬，以MTT法檢測其外周血淋巴細胞(PBL)的增殖反應(yīng)活性，以ELISA檢測血清SVDV特異抗體變化，以微量中和試驗檢測其中和抗體水平，以攻毒保護試驗評價其誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)抵抗強毒攻擊的能力。 結(jié)果表明，SVDVHK'70株衣殼蛋白基因長234

3、6nt，編碼782aa；各結(jié)構(gòu)蛋白VP2(1B)、VP3(1C)和VP1(1D)之間潛在裂解位點為Gln/Gly；SVDVHK'70株屬于第二基因群(GroupⅡ)。SVDV衣殼蛋白的二級結(jié)構(gòu)較為復(fù)雜，含有較多的轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲等柔性區(qū)域以及α-螺旋和β-折疊區(qū)段；SVDV農(nóng)殼蛋白的VP1、VP2和VP3上均有多個區(qū)域為B細胞優(yōu)勢抗原表位，其中，VP1蛋白的B細胞表位優(yōu)勢區(qū)域比VP2和VP3蛋白的多。重組質(zhì)粒pSCA/1BCD在BHK-

4、21細胞中可表達具有反應(yīng)原性的SVDV衣殼蛋白；在豚鼠體內(nèi)可誘導(dǎo)產(chǎn)生SVDV特異性ELISA抗體、中和抗體和淋巴細胞增值反應(yīng)，表明pSCA/1BCD在豚鼠體內(nèi)具有免疫原性；在豬體內(nèi)可誘導(dǎo)產(chǎn)生SVDV特異性的保護性免疫反應(yīng)，可使3/6的動物獲得保護，使1/6的動物推遲7d發(fā)病，使2/6的動物推遲1d發(fā)病。本研究結(jié)果提示自殺性DNA疫苗可作為防制豬水皰病候選疫苗，但其免疫效果須進一步提高。 本研究將甲病毒復(fù)制子載體用于SVDV自殺性