禽傳染性支氣管炎病毒M基因自殺性DNA疫苗及免疫效應研究.pdf

1、自殺性DNA疫苗是指將引起免疫應答的目的基因片段插入以甲病毒為基礎的質粒載體構建而成的一種新型DNA疫苗，它可引起宿主細胞調亡，并且通過抗原的高效表達刺激機體產(chǎn)生免疫應答，是更為安全有效的基因工程疫苗。雞傳染性支氣管炎病毒重要免疫原基因之一的M基因上存在重要的抗原決定簇，且具有高度保守性。M基因與病毒的復制有關，大小約700bp。已有的IBV疫苗文獻報道中關于M基因免疫效應的研究較少。本研究通過PCR擴增在兩端引入BamH I酶切位點，

2、經(jīng)酶切插入自殺性DNA疫苗載體pSCAl，構建了自殺性DNA疫苗pSCAl-M質粒，經(jīng)由菌落PCR、酶切及測序鑒定目的基因被成功克隆至自殺性DNA疫苗載體pSCAl，且方向正確。以1：20的配比加入脂質體作佐劑，制備了工BV M基因的自殺性DNA疫苗。分別取等量的重組質粒pSCAl-M、常規(guī)IBV M基因DNA疫苗質粒pcDNAM、空載體pSCAl轉染Vero細胞。48h后經(jīng)間接免疫熒光試驗觀察發(fā)現(xiàn)，pSCA-M以及pcDNAM轉染組細

3、胞漿均可見特異性亮綠色熒光，pSCAl空載體組無熒光為陰性。證實自殺性DNA疫苗載體能成功表達M基因。 為評價IBV自殺性DNA疫苗的免疫效應，分別用構建的自殺性DNA疫苗pSCAl-M、常規(guī)DNA疫苗pcDNAM、空載體pSCAl和IBV滅活疫苗免疫非免疫原健康雛雞，對照組注射PBS液。自免疫后每周采血分離血清連續(xù)五周，采用間接ELISA試驗檢測血清特異性抗體IgG，結果表明：自殺性DNA疫苗產(chǎn)生針對IBV的特異性血清抗體，免

4、疫后第三周上升到峰值，隨后開始下降，其抗體水平與常規(guī)IBV DNA疫苗相當，低于滅活疫苗。用流式細胞儀(FACS)測定各組CD3<'+>、CD4<'+>、CD8<'+>動態(tài)變化，結果顯示：自殺性DNA疫苗pSCAl-M組CD3<'+>、CD4<'+>、CD8<'+>各T淋巴細胞數(shù)量平均水平均高于其余各組，在各個時間點均表現(xiàn)為差異顯著(P<0.01或P<0.05)。但在第4周左右有一個明顯的下降，之后又回升。說明自殺性DNA疫苗能誘導機體