水稻強(qiáng)弱勢(shì)籽粒灌漿差異的分子生態(tài)學(xué)機(jī)制研究.pdf

1、水稻尤其是大穗型的水稻，存在著強(qiáng)弱勢(shì)籽粒灌漿差異的現(xiàn)象，弱勢(shì)籽粒灌漿差限制了水稻高產(chǎn)潛力的發(fā)揮，如何提高弱勢(shì)籽粒的灌漿飽滿度及其千粒重是當(dāng)前水稻高產(chǎn)研究的熱點(diǎn)問題。強(qiáng)弱勢(shì)籽粒灌漿差異的形成是個(gè)復(fù)雜的分子生態(tài)學(xué)過程，涉及多個(gè)基因的表達(dá)調(diào)控。雖然前人已就此問題在分子水平上開展了大量的研究，但是關(guān)于強(qiáng)弱勢(shì)籽粒之間的蛋白表達(dá)及蛋白磷酸化修飾的差異未見報(bào)道。本研究運(yùn)用雙向電泳技術(shù)及Pro-Q磷酸化原位檢測(cè)技術(shù)，選用大穗型常規(guī)稻―金恢809‖作為研

2、究對(duì)象，動(dòng)態(tài)比較分析了強(qiáng)弱勢(shì)籽粒灌漿之間的分子生理差異。主要研究結(jié)果如下：
　　1、通過形態(tài)學(xué)及干物質(zhì)動(dòng)態(tài)分析發(fā)現(xiàn)水稻―金恢809‖存在顯著的強(qiáng)弱勢(shì)籽粒灌漿差異現(xiàn)象。強(qiáng)勢(shì)籽粒在花后5-20天，干物質(zhì)重增長迅速，而弱勢(shì)籽粒花后存在著一個(gè)滯育期，直到花后15天才啟動(dòng)灌漿，其籽粒的大小和干物質(zhì)重都比強(qiáng)勢(shì)籽粒低。在滯育期內(nèi)弱勢(shì)籽粒可溶性糖含量較高，說明碳水化合物的供應(yīng)不是限制弱勢(shì)籽粒灌漿啟動(dòng)的主要原因。通過考察不同種植季節(jié)以及不同栽培調(diào)控

3、措施下水稻強(qiáng)弱勢(shì)籽粒干物質(zhì)動(dòng)態(tài)變化，發(fā)現(xiàn)強(qiáng)勢(shì)籽粒灌漿穩(wěn)定，而弱勢(shì)籽粒灌漿易受環(huán)境所調(diào)控。合理的水肥調(diào)控僅能夠一定程度促進(jìn)弱勢(shì)籽粒的灌漿，但無法促使弱勢(shì)籽粒灌漿啟動(dòng)的提前。
　　2、為了明確限制弱勢(shì)籽粒灌漿啟動(dòng)的分子機(jī)制，構(gòu)建了弱勢(shì)籽粒滯育期及灌漿前期的蛋白表達(dá)及磷酸化蛋白表達(dá)圖譜，在弱勢(shì)籽粒灌漿啟動(dòng)過程中，共鑒定到86個(gè)蛋白點(diǎn)和38個(gè)磷酸化蛋白點(diǎn)出現(xiàn)顯著的表達(dá)變化，其中即出現(xiàn)蛋白表達(dá)變化的又出現(xiàn)磷酸化修飾變化的蛋白點(diǎn)有6個(gè)。經(jīng)過M

4、ALDI-TOF/TOF-MS及LC- MS/MS的分析，蛋白點(diǎn)全部成功得到鑒定。通過蛋白豐度及功能的分析發(fā)現(xiàn)，萌發(fā)素蛋白的上調(diào)表達(dá)及α-微管蛋白的磷酸化修飾能夠打破弱勢(shì)籽粒胚乳細(xì)胞發(fā)育的停滯，導(dǎo)致弱勢(shì)籽粒胚乳膨大，形成庫容，為下一步淀粉累積做準(zhǔn)備，而蔗糖合酶、UDP葡糖焦酸酶、ADP葡萄糖焦磷酸化酶、顆粒結(jié)合型淀粉合成酶、丙酮酸磷酸二激酶的上調(diào)表達(dá)，以及丙酮酸磷酸二激酶, ADP葡萄糖焦磷酸化酶，磷酸甘油酸酯變位酶和14-3-3蛋白的

5、磷酸化修飾導(dǎo)致了淀粉合成行為的啟動(dòng)。與此同時(shí)，弱勢(shì)籽粒從滯育期到灌漿期，磷酸戊糖途徑減弱，糖酵解途徑增強(qiáng)，產(chǎn)生更多的能量及中間產(chǎn)物供弱勢(shì)籽粒胚乳細(xì)胞的增殖及淀粉的合成。
　　3、為了明確強(qiáng)弱勢(shì)籽粒灌漿差異形成的分子機(jī)制，構(gòu)建了強(qiáng)弱勢(shì)籽粒灌漿啟動(dòng)后對(duì)應(yīng)的不同灌漿時(shí)期的蛋白表達(dá)及磷酸化蛋白表達(dá)圖譜，共鑒定到156個(gè)蛋白點(diǎn)和54個(gè)磷酸化蛋白點(diǎn)在強(qiáng)弱勢(shì)籽粒之間出現(xiàn)表達(dá)變化，其中即出現(xiàn)蛋白表達(dá)變化的又出現(xiàn)磷酸化修飾變化的蛋白點(diǎn)數(shù)有16個(gè)。經(jīng)

6、過 MALDI-TOF/TOF-MS及LC-MS/MS質(zhì)譜分析，蛋白點(diǎn)全部成功得到鑒定。研究發(fā)現(xiàn)，灌漿的前期，弱勢(shì)籽粒中可溶性糖含量高于強(qiáng)勢(shì)籽粒，淀粉合成關(guān)鍵蛋白的低豐度表達(dá)，限制了淀粉的合成；灌漿的中期，弱勢(shì)籽粒中蔗糖及淀粉相關(guān)蛋白的低豐度表達(dá)是導(dǎo)致其淀粉合成效率低的主要原因；而到了灌漿的后期，碳水化合物供應(yīng)的不足又成為限制其淀粉合成的主要原因。磷酸化分析發(fā)現(xiàn)，葡糖磷酸變位酶，UDP葡糖焦酸酶，ADPG焦磷酸化酶，顆粒結(jié)合型淀粉合成酶

7、、磷酸化酶及丙酮酸磷酸二激酶在強(qiáng)弱勢(shì)籽粒之間存在著磷酸化修飾的差異，暗示著在磷酸化修飾層面調(diào)控強(qiáng)弱勢(shì)籽粒淀粉合成關(guān)鍵酶活性差異的可能性，同時(shí)也發(fā)現(xiàn)這些淀粉合成關(guān)鍵酶會(huì)通過磷酸化修飾并在14-3-3的調(diào)控下，形成淀粉酶復(fù)合體。此外，在弱勢(shì)籽粒灌漿過程中糖酵解、三羧酸循環(huán)及乙醇代謝途徑相關(guān)蛋白的表達(dá)量底，導(dǎo)致其碳流通量低，產(chǎn)生供胚乳細(xì)胞分化及淀粉合成的能量及前體相對(duì)強(qiáng)勢(shì)籽粒較少，限制了弱勢(shì)籽粒庫容的形成及淀粉的合成，而肌動(dòng)蛋白，腫瘤翻譯調(diào)控

8、蛋白及微管蛋白又限制了弱勢(shì)籽粒胚乳細(xì)胞的分化。
　　4、依據(jù)比較蛋白組學(xué)結(jié)果，篩選了7個(gè)限制弱勢(shì)籽粒灌漿啟動(dòng)及9個(gè)導(dǎo)致弱勢(shì)籽粒灌漿不充分的關(guān)鍵蛋白，蛋白豐度分析發(fā)現(xiàn)這些蛋白在強(qiáng)弱勢(shì)籽粒之間存在著時(shí)空表達(dá)差異，其中14-3-3蛋白被認(rèn)為在強(qiáng)弱勢(shì)籽粒灌漿差異形成的過程中具有重要調(diào)控作用。進(jìn)一步通過親和層析技術(shù)探討了籽粒中14-3-3蛋白的互作網(wǎng)絡(luò)，共鑒定到24個(gè)互作蛋白，發(fā)現(xiàn)淀粉合成過程的ADPG焦磷酸化酶、淀粉分支酶、支鏈淀粉酶，轉(zhuǎn)

9、化酶及丙酮酸磷酸二激酶與14-3-3蛋白存在著緊密的互作關(guān)系。 LC-MS/MS/MS分析發(fā)現(xiàn)籽粒中14-3-3蛋白存在著絲氨酸和蘇氨酸的磷酸化位點(diǎn)，據(jù)此認(rèn)為14-3-3在強(qiáng)弱勢(shì)籽粒之間的蛋白及磷酸化修飾差異是導(dǎo)致強(qiáng)弱勢(shì)籽粒淀粉合成差異及對(duì)環(huán)境產(chǎn)生不同響應(yīng)機(jī)制的一個(gè)關(guān)鍵信號(hào)調(diào)控因子。
　　綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)水稻―金恢809‖存在著顯著的強(qiáng)弱勢(shì)籽粒灌漿差異現(xiàn)象，進(jìn)一步運(yùn)用比較蛋白組學(xué)策略分析了強(qiáng)弱勢(shì)籽粒灌漿過程中基因的時(shí)空表達(dá)變化