海水海泥中病原性副溶血性弧菌時間分布及檢出方法比較研究.pdf

1、目的：副溶血性弧菌(Vibrioparahaemolyticus,V.p)主要分布于沿岸海水、海河交界處及海產(chǎn)品中，是引起沿海地區(qū)食物中毒的主要病原微生物，而采用一般的細菌培養(yǎng)分離方法很難從環(huán)境樣品(海水、海泥)中檢出神奈川現(xiàn)象陽性并且產(chǎn)生耐熱直接溶血毒素(ThermostableDirectHemolysin，TDH)副溶血性弧菌。本課題研究TDH陽性副溶血性弧菌在海水、海泥中的分布及如何提高海水、海泥中病原性副溶血性弧菌的檢出率，從

2、而為預防由副溶血性弧菌引起的食物中毒的提供依據(jù)。 方法：用MPN法檢測靜岡縣海水、海泥中副溶血性弧菌數(shù)。三次增菌后采用PCR法檢測樣品培養(yǎng)液中tdh遺傳因子的有無，用K型血清致敏免疫磁珠進行對帶有特定K型抗原副溶血性弧菌的濃縮收集，再通過接種于神奈川現(xiàn)象培養(yǎng)基，挑選出致病性的產(chǎn)生TDH的副溶血性弧菌。對分離到的TDH陽性副溶血性弧菌菌株進行脈沖場凝膠電泳比較。 結(jié)果：海水、海泥中副溶血性弧菌數(shù)量7月份～9月份最多，與副溶

3、血性弧菌食物中毒多發(fā)季節(jié)相一致，每100ml海水及每100g海泥中7、8、9三個月的副溶血性弧菌MPN值均在103以上，tdh陽性的副溶血性弧菌數(shù)約占海水、海泥中副溶血性弧菌總數(shù)的1/1000～1/100，有時甚至在1/1000以下。由PCR法測得45.5％(5/11)的海水及36.4％(4/11)的海泥中的副溶血性弧菌帶有tdh遺傳因子。對tdh陽性檢體培養(yǎng)液用免疫磁珠對帶有特定K抗原的菌株進行濃縮、收集后，接種于神奈川現(xiàn)象培養(yǎng)基，分

4、別從1份海水和1份海泥中檢出神奈川現(xiàn)象陽性并且產(chǎn)生TDH(反相被動血球凝集結(jié)果均為陽性反應)的副溶血性弧菌，血清型為O3：K6。該血清型與同年靜岡縣境內(nèi)發(fā)生的V.p食物中毒患者分離菌株中檢出率最高的血清型一致。經(jīng)SfiⅠ，NotⅠ限制性內(nèi)切酶處理后，脈沖場凝膠電泳比較，海水與一名患者分離菌株、海泥與另外兩名患者分離菌株的PFGE指紋基本相同。三次增菌培養(yǎng)后的副溶血性弧菌O3：K6菌株分離率高于僅用堿性蛋白胨水增菌的。同一份樣品、同樣進行

5、三次增菌培養(yǎng)經(jīng)免疫磁珠處理后的O3：K6菌株分離率高于未經(jīng)處理的。這說明免疫磁珠法對帶有特定K型抗原的副溶血性弧菌起到了明顯的濃縮和收集作用。 結(jié)論：與一般的細菌培養(yǎng)分離法相比，三次增菌培養(yǎng)法、PCR法、免疫磁珠法和神奈川現(xiàn)象的結(jié)合使用，可提高海水、海泥中病原性副溶血性弧菌的檢出率。脈沖場凝膠電泳結(jié)果從分子生物學的角度表明了海水、海泥TDH陽性副溶血性弧菌O3：K6菌株與食物中毒患者分離菌株的同源性。本課題為解決難于從環(huán)境樣品中