衰老及相關(guān)疾病中線粒體損傷與保護(hù)機(jī)制研究.pdf

1、在闡述衰老現(xiàn)象的多種理論中，自由基衰老理論近年來受到廣泛重視，得到眾多實驗證據(jù)支持。自由基衰老理論認(rèn)為，在衰老及相關(guān)疾病(如帕金森病(Parkinson’sdisease，PD)，阿爾茨海默病(Alzheimer’sdisease，AD))中，自由基對細(xì)胞內(nèi)生物大分子(核酸、脂類、蛋白等)產(chǎn)生氧化損傷，損傷隨年齡累積從而損害細(xì)胞功能，導(dǎo)致細(xì)胞功能衰退或喪失，最終造成機(jī)體衰老及老年性疾病。 本研究以線粒體為研究重點，從線粒體核酸、

2、酶學(xué)、特征蛋白表達(dá)等方面在體外及活體模型作了以下幾方面探索： 一．改良PCR-RFLP法測定異質(zhì)性線粒體基因相對含量 發(fā)生線粒體病變的細(xì)胞或受到活性氧攻擊的線粒體中往往存在線粒體基因異質(zhì)性現(xiàn)象，測定異質(zhì)性線粒體基因的相對含量對于了解線粒體基因功能及基因診斷具有一定的意義。我們在研究ECV304細(xì)胞線粒體基因D-LOOP區(qū)過程中，通過克隆測序，發(fā)現(xiàn)在ECV304細(xì)胞線粒體基因513堿基存在A／G異質(zhì)性，用傳統(tǒng)PCR-RFL

3、P、3’端特異引物法無法測定異質(zhì)性基因的相對含量。通過對傳統(tǒng)PCR-RFLP法的改進(jìn)，依據(jù)ECV304細(xì)胞中線粒體基因(D—LOOP區(qū))異質(zhì)性位點，采用兩輪PCR法，第一輪PCR膠回收產(chǎn)物為模板，設(shè)計半巢式引物作第二輪PCR，并在第二輪PCR中引入限制性內(nèi)切酶位點，酶切產(chǎn)物行瓊脂糖電泳，測定異質(zhì)性線粒體基因的相對含量。發(fā)現(xiàn)ECV304細(xì)胞中存在513A／G異質(zhì)性，二者比例約為1／3。改良PCR-RFLP法測定異質(zhì)性線粒體基因相對含量較為

4、簡單可靠，適用于異質(zhì)性線粒體基因的研究。 二．黃素單核苷酸(FMN)對羥自由基(·OH)損傷線粒體酶復(fù)合物1(complexⅠ)作用機(jī)制研究 線粒體營養(yǎng)素假說認(rèn)為，線粒體內(nèi)的多種能量代謝相關(guān)酶在氧化損傷過程中，如果適當(dāng)補(bǔ)充與線粒體內(nèi)能量及物質(zhì)代謝相關(guān)的輔酶、輔基、底物等，可以部分地改善相關(guān)酶的功能，修復(fù)線粒體損傷。為驗證以上假說，本實驗制備體外·OH損傷的線粒體模型，觀察黃素單核苷酸(FMN)對·OH損傷線粒體酶復(fù)合物1

5、(complexⅠ)作用，分析FMN與complexⅠ的相互作用機(jī)理。本研究用差速離心法分離大鼠肝線粒體，·OH體外損傷線粒體，氧電極法測定線粒體耗氧速率，比色法檢測線粒體complexⅠ動力學(xué)參數(shù)及線粒體內(nèi)MDA、GSH含量及SOD活性。發(fā)現(xiàn)·OH損傷后，線粒體3態(tài)、4態(tài)(state3，state4)耗氧速率、complexⅠ最大反應(yīng)速度(Vm)降低，但呼吸控制率(respiratorycontrolratio，RCR)、磷氧比值(P

6、／O)及complexⅠ米氏常數(shù)(Km)不變，線粒體中GSH含量下降，SOD活性降低，MDA含量升高。損傷線粒體補(bǔ)充165ngFMN／ml可部分恢復(fù)NADH氧化呼吸鏈耗氧速率，82．5—165ngFMN／mgprotein可顯著提高·嘣損傷的線粒體復(fù)合物Ⅰ的最大反應(yīng)速度(Vm)。損傷線粒體補(bǔ)充較低劑量的FMN(FMN＜82．5ngFMN／ml)，線粒體中GSH、SOD、MDA含量不發(fā)生變化，在較高劑量FMN時(＞165ngFMN／ml)

7、，SOD活性升高，但線粒體MDA含量升高，GSH含量下降。實驗結(jié)果提示：FMN能夠提高氧化損傷線粒體復(fù)合物Ⅰ活性，促進(jìn)complexⅠ呼吸途徑的state3耗氧速率，但不能直接清除·OH及其它自由基。FMN可能通過保護(hù)complexⅠ中的酶結(jié)合／活性位點免受·OH等自由基攻擊從而維持酶活性。 三．脂質(zhì)過氧化終產(chǎn)物丙二醛影響線粒體功能的機(jī)制研究 針對以上研究中自由基損傷引發(fā)的線粒體內(nèi)脂質(zhì)過氧化終產(chǎn)物丙二醛(MDA)含量升高

8、現(xiàn)象，為探索MDA在線粒體內(nèi)的累積對線粒體呼吸鏈復(fù)合物及線粒體內(nèi)相關(guān)酶活性的影響．本實驗采用不同濃度MDA體外干預(yù)大鼠肝臟線粒體，氧電極法檢測線粒體呼吸控制率(RCR)、磷氧比值(P／O)，測定呼吸鏈四種復(fù)合物及α一酮戊二酸脫氫酶、丙酮酸脫氫酶、蘋果酸脫氫酶活性。發(fā)現(xiàn)線粒體經(jīng)MDA作用后，以蘋果酸／谷氨酸或琥珀酸作底物，線粒體兩條呼吸呼吸途徑對MDA呈現(xiàn)不同的耐受力，前者在MDA100μM時RCR顯著降低，400μM時P／O降低，后者M(jìn)

9、DA濃度達(dá)到800μM時，線粒體P／O及RCR值顯著降低。丙酮酸脫氫酶及α一酮戊二酸脫氫酶分別在50μM和100μM時活性下降，而MDA濃度達(dá)到1mM時，蘋果酸脫氫酶活性降低。呼吸鏈復(fù)合物Ⅰ和Ⅱ分別在MDA400μM和800μM時最大反應(yīng)速度(Vm)降低，但MDA(0～3．2mM)對呼吸鏈復(fù)合物Ⅲ和Ⅳ的Vm及Km沒有影響。MDA體外研究結(jié)果提示，MDA對線粒體呼吸鏈及α一酮戊二酸脫氫酶、丙酮酸脫氫酶、蘋果酸脫氫酶存在不同程度的損傷作用，

10、不同酶對MDA損傷的敏感程度有所差異，本研究中線粒體內(nèi)相關(guān)酶受MDA損傷的次序可能是：丙酮酸脫氫酶、α一酮戊二酸脫氫酶、呼吸鏈復(fù)合物Ⅰ、呼吸鏈復(fù)合物Ⅱ、蘋果酸脫氫酶、呼吸鏈復(fù)合物Ⅲ、Ⅳ。 四．α一硫辛酸對D-gal早衰小鼠的線粒體作用機(jī)制研究。 根據(jù)二和三中研究的結(jié)果，ROS及MDA累積可能首先損傷線粒體內(nèi)能量代謝相關(guān)酶α一酮戊二酸脫氫酶、丙酮酸脫氫酶，而兩種脫氫酶復(fù)合物中，α一硫辛酸(α—lipoicacid，隊)均為

11、酶催化輔基，在防治ROS及繼發(fā)反應(yīng)所造成的線粒體功能損傷中，可能具有靶向性線粒體功能保護(hù)作用。為觀察α-LA是否對氧化應(yīng)激條件下的線粒體功能損傷具有保護(hù)作用，本實驗選擇8周齡雄性C57BL／6小鼠，分為4組(每組18只)：A對照組，BD-ga1模型組，C模型加藥組，D對照加藥組，B、C組按1OOmg／kg／day皮下注射D—gal6周，A、D組注射等量生理鹽水。C、D組小鼠自第3周起，按100mgLA／kg／day腹腔注射，持續(xù)3周。第

12、6周末，提取小鼠肝、腦線粒體，氧電極法測定線粒體呼吸，分光光度法檢測線粒體復(fù)合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ酶動力學(xué)。結(jié)果：D-gal注射6周后，小鼠肝、腦線粒體琥珀酸呼吸鏈呼吸控制率降低，P／O比值下降，補(bǔ)充LA后，小鼠腦、肝線粒體琥珀酸呼吸鏈呼吸功能顯著改善。呼吸鏈酶動力學(xué)結(jié)果顯示，早衰小鼠肝線粒體復(fù)合物Ⅱ最大反應(yīng)速度增高，腦線粒體呼吸鏈酶動力學(xué)未見顯著變化。結(jié)果提示，肝、腦線粒體琥珀酸呼吸鏈功能紊亂可能是D—gal所致小鼠早衰的重要病理特征，攝

13、入LA可保護(hù)D-gal引起的琥珀酸呼吸鏈呼吸功能異常。五．雙向電泳法分析LA對α-synuclein轉(zhuǎn)基因果蠅的作用機(jī)制。 在上述研究中，我們發(fā)現(xiàn)LA能夠改善D-gal致早衰小鼠琥珀酸呼吸鏈呼吸功能異常，同時發(fā)現(xiàn)在機(jī)體氧化應(yīng)激的一定階段，某些能量代謝酶活性(如琥珀酸脫氫酶)反而升高，為探索氧化應(yīng)激相關(guān)疾病(如PD)中相關(guān)蛋白表達(dá)特征及與線粒體營養(yǎng)素的相互關(guān)系，本實驗選擇雌性α-synuclein轉(zhuǎn)基因帕金森果蠅，羽化后隨機(jī)分為2

14、組，PD模型組、PD+LA組，以DDC果蠅作為正常對照組，各組均為150只。PD組及DDC組果蠅飼喂標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基，PD+LA組按20mg／1OOg標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基加入LA。各組果蠅每3天觀察攀爬能力，羽化后17天，取果蠅腦免疫熒光法觀察多巴胺能神經(jīng)元數(shù)目，提取蛋白檢測α-synuclein表達(dá)，雙向電泳篩選差異表達(dá)蛋白。發(fā)現(xiàn)羽化后17天，與DDC組果蠅相比，PD組果蠅α—synuclein表達(dá)增多，多巴胺能神經(jīng)元數(shù)目減少，PD+LA組果蠅α-s

15、ynuclein減少，多巴胺能神經(jīng)元數(shù)目恢復(fù)。雙向電泳檢測顯示，PD果蠅琥珀酸脫氫酶鐵硫蛋白亞基、黃嘌呤脫氫酶、3磷酸甘油醛脫氫酶Ⅰ表達(dá)增多，副肌球蛋白表達(dá)降低；PD+LA組果蠅上調(diào)蛋白包括果糖二磷酸醛縮酶、乙酰輔酶A合成酶等。上述結(jié)果提示，PD癥狀發(fā)展與腦內(nèi)能量代謝紊亂關(guān)系密切，LA可能通過調(diào)解果糖二磷酸醛縮酶、乙酰輔酶A合成酶等能量代謝途徑，從而協(xié)調(diào)腦內(nèi)能量代謝，降低α-synuclein表達(dá)，恢復(fù)腦內(nèi)多巴胺神經(jīng)元，改善PD果蠅模型

16、病理癥狀。 綜合上述實驗結(jié)果，我們對本研究小結(jié)如下： 1．針對線粒體基因重復(fù)性片斷較多的特點，本研究建立了一種改良PCR-RFLP法，來測定線粒體基因異質(zhì)性基因的相對含量，該法較為簡單可靠，適用于異質(zhì)性或點突變線粒體基因的研究。 2．在體外研究中初步證實，對于ROS(·OH)引發(fā)的線粒體復(fù)合物Ⅰ損傷，補(bǔ)充適量核黃素單核苷酸可以改善線粒體復(fù)合物Ⅰ活性及呼吸功能。本實驗為線粒體營養(yǎng)素假說提供了初步的體外實驗證據(jù)。

17、 3．ROS致線粒體內(nèi)膜脂質(zhì)過氧化終產(chǎn)物MDA累積，而MDA對線粒體呼吸功能及三羧酸循環(huán)相關(guān)酶存在不同程度的繼發(fā)性損傷，線粒體內(nèi)對MDA損傷最敏感的酶包括丙酮酸脫氫酶和α一酮戊二酸脫氫酶。本實驗較系統(tǒng)地研究了MDA的損傷效應(yīng)，為ROS的繼發(fā)性損傷提供了新的體外實驗證據(jù)。 4．在D—gal致早衰小鼠模型中證實，補(bǔ)充LA可以部分改善線粒體呼吸功能損傷。為LA靶向性防治線粒體損傷提供了有力證據(jù)，同時我們認(rèn)為在衰老早期階段，能量代謝