HEp-2細(xì)胞hPOT1高表達(dá)上調(diào)P21Waf1-Cip1表達(dá)的研究.pdf

1、本研究分為兩部分：
　　 第一部分:真核表達(dá)質(zhì)粒pEGFP-C2-hPOT1的構(gòu)建。
　　 目的：構(gòu)建真核表達(dá)質(zhì)粒pEGFP-C2-hPOT1。
　　 方法：采用TRIzol從慢性粒細(xì)胞白血病K562細(xì)胞中提取總RNA，并將總RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA后采用高保真的Taq酶對(duì)hPOT1進(jìn)行擴(kuò)增，隨后將擴(kuò)增產(chǎn)物插入真核表達(dá)載體pEGFP-C2，構(gòu)建真核表達(dá)質(zhì)粒pEGFP-C2-hPOT1，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，采用基因測(cè)序等方

2、法鑒定pEGFP-C2-hPOT1。
　　 結(jié)果：真核表達(dá)質(zhì)粒pEGFP-C2-hPOT1經(jīng)測(cè)序確認(rèn)未發(fā)生堿基突變與移碼，且與GeneBank中hPOT1的參考序列(NM_015450.2)完全匹配。
　　 結(jié)論：成功構(gòu)建真核表達(dá)質(zhì)粒pEGFP-C2-hPOT1
　　 第二部分：Hep-2細(xì)胞hPOT1高表達(dá)上調(diào)P21Waf1/Cip1表達(dá)的研究。
　　 目的：研究Hep-2細(xì)胞hPOT1高表達(dá)對(duì)P21W

3、af1/Cip1表達(dá)水平的影響及其可能的機(jī)制。
　　 方法：①實(shí)時(shí)熒光定量PCR分別檢測(cè)實(shí)驗(yàn)組（Hep-2細(xì)胞轉(zhuǎn)染pEGFP-C2-hPOT1）和對(duì)照組（Hep-2細(xì)胞轉(zhuǎn)染pEGFP-C2）hPOT1 mRNA和P21 mRNA的水平；②激光共聚焦顯微鏡檢測(cè)GFP-hPOT1融合蛋白及MDM2在Hep-2細(xì)胞中的定位；③Western blot檢測(cè)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組中GFP-hPOT1融合蛋白、MDM2、P53、P21Waf1/Ci

4、p1等蛋白的表達(dá)水平。
　　 結(jié)果：①當(dāng)使用4μg質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Hep-2細(xì)胞24hr和48hr時(shí)，實(shí)驗(yàn)組hPOT1 mRNA水平分別為對(duì)照組的92233.29和25870.14倍，且僅有98KD大小的GFP-hPOT1融合蛋白的表達(dá)，而對(duì)照組表達(dá)27KD大小的GFP蛋白；②Hep-2細(xì)胞中的GFP-hPOT1融合蛋白主要定位于細(xì)胞核中，但細(xì)胞漿中也存在少量的GFP-hPOT1融合蛋白；③實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組中P21 mRNA的水平差異不明

5、顯，但實(shí)驗(yàn)組中P21Waf1/Cip1的水平顯著高于對(duì)照組，且隨著pEGFP-C2-hPOT1轉(zhuǎn)染量的增加，GFP-hPOT1融合蛋白的表達(dá)量不斷增加，P21Waf1/Cip1的表達(dá)量隨著GFP-hPOT1融合蛋白的增加而不斷上調(diào)；④實(shí)驗(yàn)組MDM2表達(dá)水平明顯高于對(duì)照組，但兩組間P53水平變化不明顯；⑤實(shí)驗(yàn)組GFP-hPOT1融合蛋白與MDM2能夠共同定位于同一位點(diǎn)。
　　 結(jié)論：Hep-2細(xì)胞中hPOT1的高表達(dá)導(dǎo)致P21Wa