RNAi技術(shù)干擾Hep-2細(xì)胞PTTG1基因的初步研究.pdf

1、腫瘤是與多基因、多因素相關(guān)的疾病，大多數(shù)腫瘤的發(fā)生與原癌基因的突變、過度表達(dá)以及抑癌基因的突變、失活相關(guān)。抑制腫瘤相關(guān)基因的表達(dá)一直是研究新型抗腫瘤方法的重要思路。
　　 RNA干擾(RNAinterference，RNAi)現(xiàn)象發(fā)現(xiàn)于1995年，是在轉(zhuǎn)錄后水平沉默相應(yīng)基因表達(dá)的基因阻斷新技術(shù)，是近幾年基因治療的熱點(diǎn)。RNAi技術(shù)的原理是小干擾RNA(siRNA)利用堿基互補(bǔ)的原理，引導(dǎo)RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物(RISC)特異性識

2、別并結(jié)合目的基因的mRNA，引發(fā)mRNA降解，抑制腫瘤相關(guān)蛋白質(zhì)的生成，誘使腫瘤細(xì)胞凋亡或使其向成熟方向分化，從而抑制腫瘤增殖。
　　 垂體瘤轉(zhuǎn)化基因(PTTG)在正常細(xì)胞的增殖、分化及凋亡過程中起重要作用。研究表明，PTTG1基因的高表達(dá)與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。利用RNAi技術(shù)沉默人喉癌Hep-2細(xì)胞中PTTG1基因的表達(dá)，阻止或延緩腫瘤細(xì)胞的生長具有現(xiàn)實(shí)意義和潛在的臨床應(yīng)用價值。
　　 本研究根據(jù)GenBank

3、中登錄的人PTTG1基因mRNA序列(NM_004219.2)，利用美國Applied Biosystems公司提供的siRNA在線設(shè)計(jì)軟件篩選了針對mRNA序列上2個不同靶位點(diǎn)的2對互補(bǔ)DNA單鏈，分別稀釋為相同濃度后將互補(bǔ)單鏈分別等量混勻，退火為雙鏈DNA分子，分別命名為PTTG1a和PTTG1b。兩雙鏈DNA分子5’端和3’端分別帶有EcoRI、BamHI黏性末端。
　　 真核表達(dá)質(zhì)粒載體plk0.1-puro經(jīng)EcoRI

4、、BamHI雙酶切后，回收6312bp的大片段，與PTTG1a和PTTG1b分別連接，構(gòu)建了表達(dá)短發(fā)夾RNA(shRNA)的2種重組質(zhì)粒。經(jīng)雙酶切鑒定和測序鑒定，2種重組質(zhì)粒構(gòu)建成功，分別命名為plk0.1-puro/PTTG1a和plk0.1-puro/PTTG1b。提質(zhì)粒并經(jīng)分光光度計(jì)測定，表明兩種重組質(zhì)粒溶液的純度均較高，可應(yīng)用于轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)。
　　 同時，將嘌呤霉素稀釋為8種不同濃度，加入到培養(yǎng)的人喉癌Hep-2細(xì)胞系，持續(xù)

5、培養(yǎng)14d，觀察嘌呤霉素對細(xì)胞存活的影響。
　　 重組質(zhì)粒plk0.1-puro/PTTG1a和plk0.1-puro/PTTG1b均稀釋為不同濃度，在脂質(zhì)體LipofectamineTM2000介導(dǎo)下轉(zhuǎn)染Hep-2細(xì)胞系，用嘌呤霉素篩選，于轉(zhuǎn)染12d后收集細(xì)胞，分別提取總RNA、蛋白質(zhì)，以β-actin為內(nèi)參，采用RT-PCR和Westemblot技術(shù)分別檢測PTTG1基因的mRNA、蛋白質(zhì)的相對表達(dá)水平。結(jié)果顯示，與空白對照

6、組相比，隨質(zhì)粒濃度的增加，PTTG1基因mRNA、蛋白質(zhì)的相對表達(dá)水平均逐漸降低；6孔板中每孔轉(zhuǎn)染1000ng、1200ng質(zhì)粒時，plk0.1-puro/PTTG1a對PTTG1基因的抑制率可達(dá)70％以上，plk0.1-puro/PTTG1b的抑制率則低于20％。故后續(xù)實(shí)驗(yàn)以plk0.1-puro/PTTG1a進(jìn)行操作。
　　 同一濃度(1000ng/孔)的重組質(zhì)粒plk0.1-puro/PTTG1a在脂質(zhì)體介導(dǎo)下轉(zhuǎn)染培養(yǎng)于6

7、孔板的Hep-2細(xì)胞系，經(jīng)嘌呤霉素篩選后，分別在轉(zhuǎn)染后7d、12d、18d收集細(xì)胞，提取總RNA、蛋白質(zhì)，以β-actin為內(nèi)參，分別以RT-PCR、Westernblot技術(shù)檢測PTTG1基因mRNA、蛋白質(zhì)相對表達(dá)水平。結(jié)果顯示，與空白對照組相比，隨時間的延長，PTTG1基因mRNA、蛋白質(zhì)的相對表達(dá)水平均逐漸降低；轉(zhuǎn)染超過12d時，plk0.1-puro/PTTG1aPTTG1基因mRNA、蛋白質(zhì)的相對表達(dá)水平下降70％以上。