saRNA上調(diào)p21WAF1-CIP1和VEZT基因?qū)ξ赴┘?xì)胞惡性行為影響的研究.pdf

1、研究背景和目的:
　　胃癌是世界范圍內(nèi)發(fā)病率最高同時(shí)也是致死率最高的惡性腫瘤之一，僅2012年，新診斷的胃癌患者就達(dá)到952000人;在我國(guó)其發(fā)病率及致死率在所有惡性腫瘤中更是首屈一指。從全球范圍來(lái)看，近年來(lái)胃惡性腫瘤的發(fā)病率逐年降低，但是由于總?cè)丝跀?shù)目的增多，人均壽命的增長(zhǎng)及老年人的增多等不同原因，新的胃惡性腫瘤患者數(shù)目在不斷增加。目前認(rèn)為胃癌的發(fā)生是多種因素相互作用的結(jié)果，而癌基因的異常表達(dá)是其不可或缺的一部分，即與胃癌發(fā)生發(fā)

2、展相關(guān)的原癌基因的異常高表達(dá)和/或抑癌基因的反常低表達(dá)甚至沉默是導(dǎo)致胃惡性腫瘤不斷進(jìn)展的重要致病因素，因此深入研究能夠?qū)е挛赴┑母鞣N遺傳物質(zhì)的變化尤其是基因的脫變、缺失等在胃癌進(jìn)展中的作用機(jī)制，找到治療胃惡性腫瘤的新途徑或者是新的靶點(diǎn)，可以為其預(yù)防以及治療提出切實(shí)可行的的方法或途徑。
　　早在1969年Britten等就已經(jīng)提出激活RNA(activator RNA)的概念，但未獲得證實(shí)，此后直到2006年Li和Janowski等

3、才分別發(fā)現(xiàn)并命名saRNA和RNAa:小分子的雙鏈非編碼RNA可以上調(diào)或增強(qiáng)靶基因的表達(dá)，而這種效應(yīng)主要發(fā)生在DNA進(jìn)行轉(zhuǎn)錄的時(shí)候，因此這種現(xiàn)象叫RNA激活(RNAa)，而這種小分子的雙鏈非編碼RNA則稱為激活小RNA（saRNA）。隨后有關(guān)RNAa原理及作用機(jī)制的研究被不斷地報(bào)道，進(jìn)一步證實(shí)了RNAa的可行性。
　　p21WAF1/ CW1(p21)，是一種受體廣泛的細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶(CDK)抑制劑，位于6p染色體，編碼分

4、子量為21k-Da的蛋白質(zhì)，是野生型p53抑癌基因應(yīng)對(duì)各種因素引起的基因損傷的下游激活產(chǎn)物，p21可以通過(guò)多種細(xì)胞信息傳導(dǎo)途徑調(diào)節(jié)細(xì)胞周期，改變細(xì)胞周期的進(jìn)程調(diào)控細(xì)胞的增殖，這其中最為重要的是通過(guò)抑制某種特定的CDK復(fù)合物的活性，使細(xì)胞周期停止在G1期。針對(duì)p21WAF1/ CIP1(p21)基因的小激活RNA(saRNA)，dsP21-322，已經(jīng)在肝癌，肺癌，膀胱癌等多種癌細(xì)胞系中驗(yàn)證了有效性，但是在胃癌細(xì)胞中卻未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。本研究

5、擬應(yīng)用RNA激活技術(shù)重新激活胃癌細(xì)胞中p21WA1/ CIP1(p21)基因的表達(dá)，明確小激活RNA(saRNA)轉(zhuǎn)染胃癌細(xì)胞SGC-7901和M-28的最佳條件乃至發(fā)揮激活/上調(diào)作用的必要因素，研究其對(duì)靶細(xì)胞中的特定基因啟動(dòng)子的影響，進(jìn)一步明確RNAa對(duì)惡性腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移等生物學(xué)行為的影響，為胃癌的基因治療提供必要的理論依據(jù)。
　　在前期的相關(guān)研究中，本課題組的實(shí)驗(yàn)人員已經(jīng)驗(yàn)證了saRNA（dsP21-322）在體外

6、培養(yǎng)的胃癌細(xì)胞SGC-7901和M-28中的生物學(xué)作用。為進(jìn)一步研究其作用機(jī)制，我們選取了由本課題組首次發(fā)現(xiàn)的抑癌基因VEZT為小激活RNA(saRNA)的靶基因。VEZT基因是近年新發(fā)現(xiàn)的與胃癌的發(fā)生發(fā)展息息相關(guān)的抑癌基因。VEZT-在染色體的位置是12q22，具有12個(gè)外顯子和11個(gè)內(nèi)含子，編碼的是一種由相連的三個(gè)組份組成的跨膜蛋白。VEZT蛋白主要包括三部分:短的細(xì)胞外區(qū)域，跨膜區(qū)域和長(zhǎng)的細(xì)胞內(nèi)區(qū)域，其中細(xì)胞外區(qū)域結(jié)合肌球蛋白ⅦA

7、(myosinⅦA)。前期的相關(guān)實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，上調(diào)胃SGC-7901和M-28細(xì)胞中VEZT的表達(dá)可以抑制胃SGC-7901和M-28細(xì)胞的生長(zhǎng)、侵襲和遷移;VEZT的表達(dá)受啟動(dòng)子區(qū)特定部位的甲基化的影響，此外某一些非編碼的由22個(gè)核苷酸組成的單鏈microRNA也能夠影響VEZT的表達(dá)，而這種影響因素又和saRNA及RNAa上調(diào)目的基因的機(jī)制密切相關(guān)。因此為進(jìn)一步證實(shí)saRNA的激活效應(yīng)，以及探索saRNA的設(shè)計(jì)原則和作用機(jī)制，本研究

8、針對(duì)VEZT的肩動(dòng)子序列，通過(guò)生物學(xué)軟件設(shè)計(jì)了幾條saRNA。隨后通過(guò)Western Blot以及qRT-PCR篩選出能夠顯著提高VEZT蛋白和mRNA的含量的saRNA序列，然后以篩選出的saRNA轉(zhuǎn)染胃癌細(xì)胞，進(jìn)行相關(guān)實(shí)驗(yàn)。同時(shí)，構(gòu)建pGPU6/GFP/Neo-shRNA表達(dá)載體加以轉(zhuǎn)染，以排除saRNA的脫靶效應(yīng)，從而進(jìn)一步明確saRNA的靶向效應(yīng)對(duì)胃癌細(xì)胞增殖、侵襲及遷移的影響。
　　方法:
　　通過(guò)查找相關(guān)文獻(xiàn)獲取

9、針對(duì)p21WAF1/ C1P1(p21)基因的有效saRNA序列，即dsP21-322，以及dsControl（陰性對(duì)照序列）并加以合成。將不同濃度的dsP21-322轉(zhuǎn)染胃癌細(xì)胞SGC-7901和M-28中。通過(guò)Western Blot篩選最合適的轉(zhuǎn)染濃度。然后用選定的dsP21-322濃度處理SGC-7901和M-28細(xì)胞，處理時(shí)間長(zhǎng)短各不相同。通過(guò)Western Blot篩選最合適的作用時(shí)間。按照上述篩選出的saRNA最佳作用濃度

10、和時(shí)間，將dsP21-322、陰性對(duì)照序列(dsControl)均分別轉(zhuǎn)入人胃SGC-7901和M-28細(xì)胞，即dsP21-322轉(zhuǎn)染的SGC-7901和M-28作為實(shí)驗(yàn)組，dsControl轉(zhuǎn)染的SGC-7901和M-28起陰性對(duì)照的作用，即dsControl組，用不含任何RNA序列的轉(zhuǎn)染試劑Lipo2000處理目的細(xì)胞作為空白對(duì)照組，Mock組。通過(guò)CCK-8實(shí)驗(yàn)，觀察并評(píng)估saRNA對(duì)胃SGC-7901和M-28細(xì)胞增殖能力的影響

11、;通過(guò)Transwell assay觀察并評(píng)估dsP21-322對(duì)胃SGC-7901和M-28細(xì)胞侵襲和遷移能力的影響，
　　通過(guò)生物學(xué)軟件設(shè)計(jì)針對(duì)胃癌細(xì)胞中抑癌基因VEZT的saRNA、dsControl序列，并加以合成。將合成好的saRNA分別轉(zhuǎn)入胃癌細(xì)胞系SGC-7901和M-28中，通過(guò)Western Blot以及qRT-PCR檢測(cè)VEZT蛋白和mRNA的含量，進(jìn)而篩選出有效的saRNA。隨后篩選出的有效saRNA被轉(zhuǎn)入人

12、胃SGC7901和M-28細(xì)胞，將同時(shí)轉(zhuǎn)有shRNA和篩選出的saRNA的SGC-7901、 M-28細(xì)胞，也就是saRNA-shRNA組，作為陰性對(duì)照，以排除saRNA的脫靶效應(yīng)，shRNA表達(dá)載體是帶有熒光標(biāo)記的pGPU6/GFP/Neo-shRNA。通過(guò)CCK-8實(shí)驗(yàn)以及Transwell assay實(shí)驗(yàn)評(píng)估篩選出的saRNA對(duì)SGC-7901和M-28惡性行為的影響。
　　結(jié)果:
　　1.dsP21-322能有效上調(diào)

13、人胃癌細(xì)胞SGC-7901和M-28 p21WAF1/CIP1(p21)基因表達(dá)，這種激活目的細(xì)胞的特定基因的行為具有時(shí)間劑量依賴性。
　　2.dsP21322的激活效應(yīng)在轉(zhuǎn)染濃度為50nM，作用時(shí)間為72h時(shí)激活效應(yīng)的綜合效果最好。
　　3.dsP21-322能夠通過(guò)上調(diào)SGC-7901和M-28細(xì)胞p21WAF1/ CIP1(p21)mRNA及蛋白質(zhì)的含量，抑制靶細(xì)胞的惡性行為。
　　4.dsVEZT-94，能通過(guò)

14、上調(diào)人胃癌細(xì)胞SGC-7901和M-28 VEZT mRNA及蛋白質(zhì)的含量，進(jìn)而抑制靶細(xì)胞的惡性行為。
　　結(jié)論:
　　在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)dsP21-322(saRNA)能夠有效上調(diào)p21WAF1/ CIP1(p21)基因的表達(dá)，提高p21WAF1/CIP1(p21)蛋白及mRNA的含量，進(jìn)而抑制胃癌細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移。此外，這種激活效應(yīng)具有時(shí)間劑量依賴性，在saRNA轉(zhuǎn)染濃度為50nM，轉(zhuǎn)染時(shí)間為72h時(shí)，激活效應(yīng)激

15、活效應(yīng)的綜合效果最好。dsVEZT-94，能通過(guò)上調(diào)體外培養(yǎng)的靶細(xì)胞系SGC-7901和M-28 VEZT mRNA及蛋白質(zhì)的含量，進(jìn)而抑制靶細(xì)胞的惡性行為。本研究中這種生物學(xué)惡性行為豐要包括增殖、侵襲和遷移。
　　saRNA通過(guò)作用于抑癌基因啟動(dòng)子的特定序列，上調(diào)或激活靶基因的表達(dá)，從而實(shí)現(xiàn)抑制胃癌細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移等惡性行為的目的，研究saRNA和RNAa的作用機(jī)制，能夠?yàn)槲赴┥踔疗渌麗盒阅[瘤的預(yù)防或者是治療提供切實(shí)可行的