C57BL-6小鼠MHC-I分子真核表達(dá)載體的構(gòu)建.pdf

1、目的：構(gòu)建C57BL/6小鼠MHC-I分子真核表達(dá)質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞并鑒定其表達(dá)，為研究分子嵌合誘導(dǎo)移植免疫耐受奠定基礎(chǔ)。
　　方法：①采用反轉(zhuǎn)錄PCR(reversetranscriptionPCR，RT-PCR)方法獲取供體C57BL/6小鼠MHC-I基因H-2Db和H-2Kb。②通過雙酶切、定向克隆技術(shù)將H-2Db和H-2Kb克隆入真核雙表達(dá)質(zhì)粒pIRES，構(gòu)建重組質(zhì)粒pIRES-H2Db-H2Kb。③使用Lipofec

2、tamine2000將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，同時(shí)設(shè)置未轉(zhuǎn)染組，轉(zhuǎn)空質(zhì)粒組。④熒光實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染后各組H-2Db和H-2Kb在mRNA水平表達(dá)情況。⑤流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)轉(zhuǎn)染后各組H-2Db和H-2Kb在蛋白水平表達(dá)情況。
　　結(jié)果：①成功獲取C57BL/6小鼠MHC-I分子H-2Db及H-2Kb的等位基因。②構(gòu)建的C57BL/6小鼠MHC-I分子真核表達(dá)質(zhì)粒經(jīng)限制性雙酶切鑒定成功正向插入pIRES質(zhì)粒載體，經(jīng)測(cè)序分析，克隆的

3、基因與GenbankC57BL/6小鼠H-2Db和H-2Kb基因序列完全相同。⑧使用脂質(zhì)體法成功將重組質(zhì)粒pIRES-H2Db-H2Kb轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞。與未轉(zhuǎn)染組和轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒組相比，轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒組H-2Db和H-2Kb基因mRNA表達(dá)分別增加632倍和904倍，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。而未轉(zhuǎn)染組與轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。④轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒組H-2Db和H-2Kb基因蛋白表達(dá)分別為(24.50±1.88)

4、％和(34.30±2.68)％，明顯高于轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒組[H-2Db(0.42±0.05)％；H-2Kb(0.12±0.03)％]及未轉(zhuǎn)染組[H-2Db(0.38±0.03)％；H-2Kb(0.10±0.02)％]，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，而轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒組和未轉(zhuǎn)染組之間蛋白表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。
　　結(jié)論：成功構(gòu)建C57BL/6小鼠MHC-I分子真核雙表達(dá)載體pIRES-H2Db-H2Kb，并實(shí)現(xiàn)其在29