神經(jīng)肽SP對C57BL-6小鼠脾NK細胞遷移及趨化因子受體表達的影響.pdf

1、目的：
　　NK細胞主要存在于肝、脾、肺和外周血。NK細胞可以利用細胞因子效能和細胞毒活性，對機體炎癥感染和抗腫瘤疾病免疫發(fā)揮關(guān)鍵性作用。NK細胞可以殺死炎癥性、病原感染性以及腫瘤性細胞，這是經(jīng)過不同種類的NK細胞表面受體發(fā)揮作用的。NK細胞可以表達不同功能和種類的受體，它們能夠與其密切聯(lián)系的細胞因子和趨化因子之間發(fā)生聯(lián)系，以此來調(diào)節(jié)其向炎癥感染以及腫瘤病灶等部位聚集、行使趨化能力或者進行其它生物學(xué)活動。
　　SP是一類神經(jīng)

2、肽物質(zhì)，而神經(jīng)肽是神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)受到各種影響或者發(fā)揮作用反應(yīng)時分泌的一類生物活性肽，其對機體進行各種免疫功能調(diào)節(jié)具有非常重要的調(diào)控作用。SP對機體免疫調(diào)節(jié)和免疫活動都有著很好的促進效應(yīng)，是體內(nèi)進行自身調(diào)節(jié)和防御機制必不可少的調(diào)節(jié)性多肽，它對機體中自然殺傷細胞的增殖能力和殺傷活性具備了雙向作用功能。自然殺傷細胞在各種趨化性細胞因子及其受體影響下，可遷移到病變部位，發(fā)揮抵抗炎癥感染和防御腫瘤侵害的免疫防御作用。通過研究SP對小鼠NK細胞遷移

3、能力和趨化因子受體表達功能的影響，為研究SP對NK細胞作用機制提供了更多線索，并為抗腫瘤癌變、抗炎癥感染及抗移植排斥等醫(yī)療活動提出新的策略。
　　方法：
　　1、C57BL/6小鼠脾臟NK細胞的提取分離。①實驗用C57BL/6小鼠處死后，獲取脾組織細胞懸液;②小鼠脾臟淋巴細胞分離，收集其中的白色懸浮層細胞;③Miltenyi MACS NK細胞分選，收集NK細胞。④測定分離純化的NK細胞活性⑤NK細胞純化率流式測定。

4、　　2、C57BL/6小鼠脾NK細胞吉姆薩染色以及熒光染色。①吉姆薩染色:NK細胞懸液涂布在載玻片;甲醇固定;吉姆薩液染色;顯微鏡觀察并拍照。②熒光染色:NK細胞封閉液封閉;NK1.1抗體孵育;熒光顯微鏡觀察拍照。
　　3、C57BL/6小鼠脾NK細胞遷移實驗:Transwell法檢測不同濃度SP（終濃度為0M、10-14M、10-12M、10-10M、10-8M、10-6M）對C57BL/6小鼠脾NK細胞遷移的影響。
　　

5、4、趨化因子受體mRNA表達的測定:不同濃度SP(終濃度為0M、10-14M、10-12M、10-10M、10-8M、10-6M)處理NK細胞6小時，Real-Time PCR檢測各實驗組趨化因子受體CCR5、CCR3、CXCR4的mRNA表達水平。
　　5、不同濃度SP（終濃度為0M、10-14M、10-12M、10-10M、10-8M、10-6M）處理NK細胞6小時，流式細胞術(shù)檢測C57BL/6小鼠NK細胞表面趨化因子受體CC

6、R5、CCR3、CXCR4的表達情況。
　　6、不同濃度SP(終濃度為0M、10-14M、10-12M、10-10M、10-8M、10-6M)處理NK細胞24小時，流式方法測定各實驗組NK細胞亞群變化。
　　結(jié)果：
　　1、C57BL/6小鼠脾NK細胞陰性分選后NK1.1陽性細胞率(％):83.00±1.91。
　　2、磁珠分選C57BL/6小鼠脾NK細胞經(jīng)吉姆薩染色和蘇木素染色:鏡下可見圓形或橢圓形細胞，細胞核

7、為橢圓形，有染色的嗜天青顆粒存在。磁珠分選C57BL/6小鼠脾NK細胞使用NK1.1熒光標記，鏡下只見紅色熒光的細胞。
　　3、在(10-14M～10-10M) SP濃度范圍內(nèi)，隨著SP濃度的增加，其促進NK細胞遷移作用逐漸增強，達到峰值，其后，在(10-10M～10-6M) SP濃度范圍內(nèi)，隨著SP濃度的增加，其促進NK細胞遷移作用逐漸減弱。
　　4、SP對3種趨化因子受體mRNA表達的影響不同。①CCR3在SP10-14

8、M、10-12M濃度時，可明顯促進其mRNA表達。②CCR5在(10-10M～10-6M) SP濃度范圍內(nèi)，可明顯促進其mRNA的表達。③CXCR4在（10-14M～10-6M）SP濃度范圍內(nèi)，其均可明顯促進其mRNA的表達。
　　5、SP對小鼠脾NK細胞表面趨化因子受體CCR3、CCR5、CXCR4表達的影響不同。①在(10-14M～10-6M) SP濃度范圍內(nèi)，陽性細胞表達逐漸下降。②在（10-14M～10-10M）SP濃度范

9、圍內(nèi)，陽性細胞表達逐漸增加，10-10M濃度時，其達到峰值，在(10-10M～10-6M) SP濃度范圍內(nèi)，其陽性細胞表達逐漸下降。
　　6、流式檢測不同濃度SP刺激NK細胞24小時，檢測結(jié)果為不同濃度SP（終濃度為0M、10-14M、10-12M、10-10M、10-8M、10-6M）影響C57BL/6小鼠脾NK細胞的亞群，增加CD27hiCD11blo、CD27hiCD11bhi、CD27loCD11bhi的陽性細胞百分率，降