腫瘤細胞核移植的重新編程和核型變化研究.pdf

1、腫瘤目前是對人類生命最大的威脅，對腫瘤的發(fā)生機制做了大量的研究工作，但仍沒有公認的能完全闡明的理論。腫瘤的細胞學特征包括以下五個方面：持續(xù)分裂增殖、去分化、逃避凋亡、轉(zhuǎn)移及血管生成。針對這幾個表型特征的抑制及逆轉(zhuǎn)治療都顯示了一定的應用前景，但仍然沒有找到可以完全逆轉(zhuǎn)腫瘤的方法。對于腫瘤逆轉(zhuǎn)的可能性及可能的機制研究是腫瘤治療的一個新視點和鍥機。2004年RudolfJaenisch將小鼠畸胎瘤細胞作為供核細胞得到核移植囊胚，提取內(nèi)細胞團注

2、入正常囊胚，最后得到嵌合體小鼠，顯示了通過核移植手段逆轉(zhuǎn)腫瘤細胞的可能性和可行性。 核移植(nucleartransfer或nucleartransplantation)是指用顯微操作的方法，將供核細胞的核移入去核的卵母細胞或早期合子內(nèi)，激活后核受體胞質(zhì)對供體核重新編程(reprogramming)，形成核移植重組胚。1997年二月Nature發(fā)表了Wilmut等的文章，即將一成年母羊乳腺細胞作為供核細胞構(gòu)建重組胚，再植入養(yǎng)母子

3、宮得到了Dolly羊。這是人類首次用體細胞核移植技術(shù)得到的哺乳類克隆動物，遺傳性質(zhì)同供給體細胞的動物完全一致。 發(fā)育成熟的體細胞和腫瘤細胞核移植后發(fā)育的過程牽涉到對移入的細胞核的重新編程。移植的細胞核重新編程是否充分是決定核移植重組卵能否繼續(xù)發(fā)育及發(fā)育程度的重要因素。J.Gurdon曾將蝌蚪腸上皮的細胞核移植到去核的受精卵中，核移植重組胚不久后便終止發(fā)育，并且有相當?shù)募毎顺霈F(xiàn)了非整倍的染色體組型。J.Gurdon又進一步選取其

4、中有健康核型的細胞作為供核細胞，將其細胞核再次移植到去核卵母細胞中，這時7％的重組胚發(fā)育為成體。RudolfJaenisch將小鼠畸胎瘤細胞作為供核細胞進行核移植也只能得到囊胚，不能進一步發(fā)育，提取核移植囊胚的內(nèi)細胞團注入正常囊胚，才能得到嵌合體小鼠。這說明伴隨發(fā)育的進行，細胞核的功能狀態(tài)發(fā)生了某種變化，只有能“恢復”到合適狀態(tài)的細胞核，才能實現(xiàn)核移植重組胚的正常發(fā)育。 本實驗在現(xiàn)有的核移植技術(shù)基礎(chǔ)上對核移植各操作過程及胚胎培養(yǎng)

5、條件進行摸索與改進，提高并穩(wěn)定核移植效率：1)用添加3％蔗糖的培養(yǎng)液短時間處理MⅡ期卵母細胞證實能實現(xiàn)小鼠MⅡ期卵母細胞核的可視化，使得去核效率達100％，并且減少去核過程中的胞質(zhì)損失，利于重組胚進一步發(fā)育。2)對比電脈沖、電脈沖+CHX、酒精+CHX、Sr2++CCB、Sr2++CHX+CCB五種重組胚激活方法的激活效果，發(fā)現(xiàn)各處理方式激活率和囊胚形成率有差異，Sr2++CHX+CCB激活效果最好。3)對比血清饑餓處理不同時間對供核細

6、胞B16細胞的損害和周期同步效果以及相應的核移植效率，發(fā)現(xiàn)血清饑餓處理3-5天的B16細胞作為供核細胞效果最好。4)對比幾種不同參數(shù)的脈沖電波的電融合效果及相應的重組胚發(fā)育效率，發(fā)現(xiàn)脈沖電壓及脈沖時程在一定范圍內(nèi)調(diào)整對融合效果沒有明顯影響，電壓過低過高或脈沖時程超出范圍對電融合不利。 將各個發(fā)育時期的體細胞核移植胚胎、腫瘤細胞核移植胚胎及孤雌激活胚胎這三組植入前胚胎的卵裂球進行彗星試驗檢測，經(jīng)軟件分析各組細胞的彗星試驗圖像，對比

7、這三組胚胎細胞的核型，觀察重新編程過程對這三組胚胎細胞核的影響，發(fā)現(xiàn)腫瘤細胞核移植重組胚細胞相對于其它幾組細胞的核型有以下異常：1、腫瘤細胞核移植胚胎細胞M期卵裂球彗星試驗圖像積分光密度分布較彌散，說明染色體異倍體比例很高。2、腫瘤細胞核移植胚2細胞期到8細胞期卵裂球行彗星試驗可見彗尾，2細胞期尾DNA百分含量最大，到4、8細胞期逐漸減小，至桑椹胚期彗尾消失。其它幾組卵裂球彗星試驗只有極少量可見彗星尾?？赡苁且驗槟[瘤細胞核移植重新編程過