腫瘤細(xì)胞核移植后早期重組胚的基因表達(dá)譜.pdf

1、第一軍醫(yī)大學(xué)博士學(xué)位論文腫瘤細(xì)胞核移植后早期重組胚的基因表達(dá)譜姓名：沈新明申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：博士專業(yè)：病理和病理生理學(xué)指導(dǎo)教師：姚開泰20030601我們以C57BL／6j小鼠卵丘細(xì)胞作為核移植供體獲得重組胚，在CE450細(xì)胞融合儀上進(jìn)行重組胚胎的融合和激活，重組胚胎的原核形成率為622％。體外培養(yǎng)72小時(shí)內(nèi)，發(fā)育到2細(xì)胞期、扯8細(xì)胞期和桑椹胚(16細(xì)胞期以上)比例分別為575％、391％和276％。用2個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記(D7Mit22和D4M

2、it204)對(duì)來(lái)源于卵丘細(xì)胞的重組胚進(jìn)行鑒定，證實(shí)重組胚來(lái)源于C57BL／6j小鼠卵丘細(xì)胞。在上述工作的基礎(chǔ)上，我們以C57BL／6j小鼠惡性黑色素瘤B16F1細(xì)胞為對(duì)象研究了腫瘤細(xì)胞惡性表型逆轉(zhuǎn)的可能性。通過(guò)染色體核型分析、裸鼠接種及HE染色證實(shí)B16F1細(xì)胞具有高度的惡性。用05％小牛血清培養(yǎng)B16F1細(xì)胞5～8天誘導(dǎo)靜止后，將其作為核移植供體構(gòu)建重組胚，經(jīng)摸索確定了該重組胚的合適融合條件為1400V／cm、40～80IIs、2次(

3、2次間隔時(shí)間為5秒)，且根據(jù)重組胚的原核形成率推斷，該腫瘤細(xì)胞中直徑810urn的細(xì)胞是核移植的最佳核供體。重組胚胎的原核形成率為536％。體外培養(yǎng)72小時(shí)內(nèi)，發(fā)育到2細(xì)胞期、48細(xì)胞期和桑椹胚(16細(xì)胞期以上)比例分別為515％、403％和263％。由于我們對(duì)B16一F1細(xì)胞的遺傳背景不清楚，為了對(duì)來(lái)源于腫瘤細(xì)胞的重組胚胎進(jìn)行鑒定，我們以轉(zhuǎn)染了EGFP基因且有較強(qiáng)綠色熒光表達(dá)的B16F1細(xì)胞為核供體，獲得的重組胚可用EGFP引物PCR

4、擴(kuò)增出目的條帶，但胚胎未見熒光表達(dá)，這可能是由于重新編程使這個(gè)外源性的基因表達(dá)失活，或者是延遲表達(dá)有關(guān)。為了進(jìn)一步了解腫瘤細(xì)胞核移植后重組胚重新編程并脫離惡性表型的機(jī)制。我們利用eDNA微陣列技術(shù)，對(duì)發(fā)育到2細(xì)胞期的重組胚進(jìn)行了基因表達(dá)譜的研究。利用SMARTeDNA合成技術(shù)，首先從上述微量樣本中抽提出低于2ng的總RNA，然后反轉(zhuǎn)錄獲得dsDNA并擴(kuò)增至152ug，從而使重組胚的基因表達(dá)譜研究成為可能。用AtlasTMMouse12微