艱難梭菌二元基因分型方法建立及方法學(xué)對(duì)比研究.pdf

1、目的：艱難梭菌（Clostridium difficile,CD）是一種能形成芽孢的革蘭陽(yáng)性厭氧粗大桿菌。上世紀(jì)70年代末被首次發(fā)現(xiàn)是引起抗生素相關(guān)性偽膜性腸炎的原因之一，近年來(lái)由艱難梭菌引起的感染（ Clostridium difficile infection,CDI）已經(jīng)成為抗生素相關(guān)性腹瀉的主要原因。其致病原因可能是由于抗生素改變了腸道正常菌群，破壞了其保護(hù)作用，使得艱難梭菌可以在結(jié)腸定植繁殖，進(jìn)而釋放兩種毒力因子-毒素A（Tc

2、dA）和B（TcdB）。臨床癥狀表現(xiàn)為輕度的自限性腹瀉到嚴(yán)重的偽膜性腸炎甚至是死亡。艱難梭菌分型技術(shù)對(duì)于追蹤艱難梭桿菌相關(guān)性腹瀉（CDAD）流行菌株的來(lái)源，調(diào)查其在全球范圍內(nèi)的傳播途徑，以及探索其致病機(jī)制等具有重要意義。隨著致病性艱難梭菌的傳播流行，已有核糖體分型（PCR ribotyping,PCR RT），脈沖場(chǎng)凝膠電泳（Pulsed Field Gel Electrophoresis,PFGE）和多位點(diǎn)序列分析（Multilocu

3、s Sequence Typing, MLST）等多種分子分型技術(shù)應(yīng)用于艱難梭菌流行病學(xué)研究。但是，這些分型方法在分辨力、重復(fù)性、可操作性、費(fèi)用和實(shí)驗(yàn)室間比對(duì)等方面存在不同的缺陷。
　　二元基因分型（Binary Typing）是一種新型的基于不同菌株上某種基因存在與否的分型技術(shù)，即根據(jù)某一個(gè)基因在同一菌種上的存在與否都可以將這一菌種分為“有”和“無(wú)”兩個(gè)群體，如果有多個(gè)類似的基因組合起來(lái)，就可以把一種細(xì)菌進(jìn)行詳細(xì)分型。具有這樣特

4、點(diǎn)的基因被稱為“二元基因”，由這些基因分析得到的不同型別就是二元基因型。它已經(jīng)成功應(yīng)用于金黃色葡萄球菌、空腸彎曲桿菌等菌種的流行病學(xué)分析。并以其操作簡(jiǎn)單快速，費(fèi)用低、高分辨力等特點(diǎn)受人們的關(guān)注。
　　本研究的目的是建立一個(gè)全新的、快速、費(fèi)用低、可操作性強(qiáng)的艱難梭菌二元基因分型方法，并將該方法與傳統(tǒng)的MLST方法作比較研究。
　　方法：應(yīng)用Mauve軟件對(duì)Genome數(shù)據(jù)庫(kù)下載的4條艱難梭菌全基因組 DNA序列進(jìn)行比對(duì)分析，初

5、步查找可能存在的大小介于500bp和1000bp之間的二元基因位點(diǎn)。以NCBI Genome數(shù)據(jù)庫(kù)中已存在的50個(gè)艱難梭菌全基因組DNA序列作為測(cè)試樣本，將每個(gè)可能的二元基因都進(jìn)行BLAST（Basic Local Alignment Search Tool）檢索，模擬分析篩選的基因位點(diǎn)在艱難梭菌上的存在情況，根據(jù)每個(gè)二元基因在50個(gè)全基因DNA序列上的存在與否，標(biāo)記為（0,1）矩陣。應(yīng)用最優(yōu)組合查詢軟件（Optimal Combina

6、tion Finder, OCF），以辛普森指數(shù)（Simpson's index,SI）作為評(píng)價(jià)分型方法分辨力的指標(biāo)，計(jì)算分析不同二元基因位點(diǎn)組合的分辨力，初步篩選最優(yōu)二元基因分型組合。以2010年2012年臨床分離的99株艱難梭菌和1株參考菌株ATCC BAA-1870（RT027）為測(cè)試樣本，進(jìn)一步優(yōu)化分析二元基因分型位點(diǎn)組合。并以核糖體分型作為參考方法進(jìn)行對(duì)比研究。確定最終的二元基因分型的位點(diǎn)組合。以挑選收集自2010至2014年

7、間不同地域和不同人群的100株艱難梭菌為測(cè)試樣本同時(shí)進(jìn)行二元基因分析和多位點(diǎn)序列分型（Multilocus sequence typing,MLST）,比較分析二元基因分析方法的優(yōu)劣。
　　結(jié)果：從Genome數(shù)據(jù)庫(kù)下載得到4條艱難梭菌全基因組DNA序列，分別為：C.difficile R20291, QCD-63q42, QCD-76w55和C.difficile630。用Mauve軟件將4個(gè)全基因組DNA序列對(duì)比分析后，共發(fā)現(xiàn)

8、50個(gè)可能存在的二元基因位點(diǎn)。以NCBI Genome數(shù)據(jù)庫(kù)中已存在的50個(gè)艱難梭菌全基因組 DNA序列作為測(cè)試樣本進(jìn)行模擬分析，對(duì)50個(gè)二元基因位點(diǎn)的不同組合進(jìn)行評(píng)價(jià)分析后，發(fā)現(xiàn)其中28個(gè)二元基因位點(diǎn)組合具有最好的分辨力，SI值為0.908。將28個(gè)二元基因位點(diǎn)設(shè)計(jì)引物對(duì)99株艱難梭菌和1株參考菌株ATCC BAA-1870（RT027型）進(jìn)行PCR檢測(cè)分型后，發(fā)現(xiàn)由其中10個(gè)基因位點(diǎn)組成最優(yōu)分型方案可以達(dá)到28個(gè)基因位點(diǎn)的分型水平，

9、SI值亦為0.908。以核糖體分型作為參考方法，對(duì)相同的100株測(cè)試菌株進(jìn)行分型，并計(jì)算分析后發(fā)現(xiàn)其SI值僅為0.847。將二元基因分型與核糖體分型方法進(jìn)行合并分析，其SI值為0.933。僅在二元基因分型的基礎(chǔ)上提高了0.025。采用10位點(diǎn)二元基因分型和MLST分型方法對(duì)收集自2010至2014年間不同地域和不同人群的100株艱難梭菌進(jìn)行比對(duì)分析后發(fā)現(xiàn)，兩種分型方法的其SI值分為0.938和0.886。二元基因分型方法顯示了很好的分辨

10、力。
　　結(jié)論：艱難梭菌二元基因分型方法是一種非常有用的分型方法，可以提供準(zhǔn)確可信的分型信息。它不僅具有快速、實(shí)用、費(fèi)用低廉等特點(diǎn)，而且具有較高的分辨力，可以在流行病學(xué)水平上提供有效的分型數(shù)據(jù)。此外，由于所選取的10個(gè)二元基因位點(diǎn)中的部分位點(diǎn)是涉及毒力和耐藥相關(guān)的功能基因，二元基因的分型結(jié)果可以讓臨床醫(yī)師直觀地了解從患者樣本中分離到菌株的功能基因，以便采取進(jìn)一步的治療措施。因此，相比較其他分型方法，二元基因分型具有很獨(dú)特的臨床意義