艱難梭狀芽孢桿菌谷氨酸脫氫酶及二元毒素的原核表達(dá)、純化.pdf

1、目的:艱難梭狀芽孢桿菌（CD）是院內(nèi)感染性腹瀉最主要的病原菌之一。2010年美國(guó)衛(wèi)生保健流行病學(xué)協(xié)會(huì)和感染病協(xié)會(huì)頒布針對(duì)難辨梭菌感染(CDI)的臨床診治指南。英國(guó)把CDI列為強(qiáng)制上報(bào)和管理病例。國(guó)內(nèi)對(duì)于CDI報(bào)道較少，原因可能是沒有快速可靠的檢測(cè)方法，而進(jìn)口檢測(cè)試劑價(jià)格昂貴且國(guó)家藥監(jiān)局還沒有批準(zhǔn)有關(guān)CD的任何檢測(cè)試劑。國(guó)外對(duì)CDI的檢測(cè)最常用的是酶免疫法(EIA)檢測(cè)谷氨酸脫氫酶（GDH）作為初篩，并聯(lián)合檢測(cè)毒素A/B。GDH是CD產(chǎn)毒

2、株與非產(chǎn)毒株的共同抗原，其產(chǎn)量高，GDH檢測(cè)靈敏度高，且出結(jié)果快速，是一種高效的初篩方法。新分離的高毒株亞型BI/NAP1/027產(chǎn)生一種新的二元毒素(CDT)，被認(rèn)為是該毒株引起高發(fā)病和高死亡的最主要原因。CDT包括兩個(gè)獨(dú)立的蛋白亞基:具有酶活性的CDTa和具有結(jié)合能力的CDTb。最新研究表明感染產(chǎn)CDT合并TcdA和TcdB菌株的死亡率有少量雜蛋白，CDTa和CDTb純度分別為70％和60％，濃度分別為1.3mg/ml和1.0mg/

3、ml。純化的目的蛋白免疫小鼠后，小鼠均產(chǎn)生了抗血清，抗血清滴度為1∶105。選取GDH免疫的小鼠進(jìn)行細(xì)胞融合，遺憾的是，最終目的未能篩選出可應(yīng)用于GDH檢測(cè)的雜交瘤細(xì)胞。
　　 結(jié)論:pET-28-GDH的重組工程菌能夠穩(wěn)定高效、可溶性地表達(dá)目的蛋白，純化的目的蛋白純度高，具有谷氨酸脫氫酶酶活性，為制備GDH單克隆抗體奠定基礎(chǔ)。pET-32-CDTa與pET-32-CDTb重組質(zhì)粒表達(dá)產(chǎn)物產(chǎn)量相對(duì)較少，且含有雜蛋白，可進(jìn)一步通過