抑制性谷氨酸門控氯離子通道胞外域的原核表達(dá)及純化研究.pdf

1、抑制性谷氨酸門控氯離子通道(Inhibitory glutamate-gated chloride ion channels， IGluCls)屬于半胱氨酸環(huán)配體門控離子通道超家族（Cys-loop LGIC superfamily）中的陰離子通道，主要分布于無脊椎動(dòng)物的中樞神經(jīng)和神經(jīng)肌肉的連接處，在控制吞咽、運(yùn)動(dòng)、感知等方面起關(guān)鍵作用。抑制性谷氨酸門控氯離子通道它是殺蟲劑的作用靶標(biāo)，僅存在于無脊椎動(dòng)物中，鑒于該靶標(biāo)的選擇性及高效、安全

2、等特點(diǎn)，建立該通道的體外篩選方法，在天然產(chǎn)物庫(kù)中篩選具有選擇毒性的殺蟲劑具有廣闊的應(yīng)用前景。本文以黑腹果蠅抑制性谷氨酸門控氯離子通道胞外域（Drosophila melanogaster inhibitory glutamate-gated chloride ion channels，DmIGluCl ECD）為研究對(duì)象，進(jìn)行了DmIGluCl ECD的亞克隆及在大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)和畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)的表達(dá)研究，并對(duì)在大腸桿菌中表達(dá)的胞外域

3、蛋白進(jìn)行了純化。主要結(jié)果如下：
　　 （1）DmIGluCl通道由胞外區(qū)（Extracellular domain，ECD）、4個(gè)跨膜區(qū)（transmembrane domain，TM）和胞內(nèi)區(qū)(intracellular domain，ICD)三部分組成?？紤]到畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)屬于真核表達(dá)系統(tǒng)，具備翻譯后加工等一系列修飾過程，首選其進(jìn)行表達(dá)。首先從本實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)構(gòu)建了的DmIGluClα全長(zhǎng)重組質(zhì)粒中克隆DmIGluClα TM

4、2-TM3環(huán)之前的313個(gè)氨基酸殘基基因片段，與穿梭質(zhì)粒Ppic9k連接，成功構(gòu)建了重組載體并成功轉(zhuǎn)化畢赤酵母宿主GS115，利用畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行表達(dá)研究。
　　 （2）擴(kuò)增了DmIGluClα ECD基因片段，同時(shí)與真核表達(dá)載體Ppic9k和原核表達(dá)載體Pet-28a-c(+)連接，限制性內(nèi)切酶酶切鑒定及序列測(cè)定表明，得到了目標(biāo)基因的真核及原核表達(dá)的陽性重組子，成功構(gòu)建了重組質(zhì)粒，并成功轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115和大腸桿菌Ro

5、setta。利用畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)和大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行表達(dá)研究。
　　 (3) 進(jìn)行基因工程菌培養(yǎng)，在大腸桿菌宿主Rosetta中，誘導(dǎo)外源蛋白DmIGluCl ECD的表達(dá)，SDS-PAGE分析發(fā)現(xiàn)外源蛋白以不可溶的包涵體形式存在于破菌沉淀中。對(duì)目標(biāo)蛋白的誘導(dǎo)條件進(jìn)行了優(yōu)化實(shí)驗(yàn)。優(yōu)化結(jié)果表明，當(dāng)誘導(dǎo)劑IPTG添加濃度為0.1mM時(shí)， 25℃誘導(dǎo)5 h將獲得占菌體總蛋白比例最高的的目標(biāo)蛋白。經(jīng)凝膠電泳光密度掃描分析可知，目標(biāo)蛋白