谷氨酸棒狀桿菌菌渣中胞壁酸的提取、純化及檢測(cè).pdf

1、背景：胞壁酸（Muramic acid，簡(jiǎn)稱Mur，C9H17NO7）是細(xì)菌細(xì)胞壁粘肽結(jié)構(gòu)的重要組成部分，是原核微生物細(xì)胞的生物標(biāo)志化合物，它已被用于作為衡量細(xì)菌和藍(lán)藻的生物量，推測(cè)不同環(huán)境中微生物總量，胞壁酸是一種睡眠促進(jìn)因子的組合物，胞壁酸是胞壁酰二肽（MDP）的組成成分之一，MDP是細(xì)胞骨架中具有免疫佐劑活性功能的最小結(jié)構(gòu)單位，胞壁酸在凝集素，潛在細(xì)菌酶抑制劑，以及抗腫瘤作用有很大研究應(yīng)用前景。
　　谷氨酸棒狀桿菌常用來發(fā)酵

2、生成不同的產(chǎn)品（如谷氨酸，賴氨酸，精氨酸，有機(jī)酸等），本實(shí)驗(yàn)所采用原材料來源于發(fā)酵谷氨酸鈉（味精）后產(chǎn)生的谷氨酸棒狀桿菌菌渣，每年產(chǎn)量可達(dá)上百萬噸，以谷氨酸棒狀桿菌菌體為主。
　　胞壁酸含量檢測(cè)方法多種多樣，可以直接通過自動(dòng)氨基酸分析法分析，也可將胞壁酸衍生化，生成有色、易揮發(fā)和穩(wěn)定的衍生化合物，再采用比色法、中紅外光譜法、氣相色譜/GC-MS/LC-MS、HPLC、TLC等法測(cè)定，菌渣、土壤等材料中胞壁酸的測(cè)定主要有GC和HPL

3、C。HPLC具有分析速度快、時(shí)間短，靈敏度高，應(yīng)用范圍廣，分辨率高，不破壞樣品等優(yōu)點(diǎn)。HPLC測(cè)糖檢測(cè)器宜選用示差折光檢測(cè)器，可以保留樣品，但靈敏度不高，不穩(wěn)定，受溫度和流動(dòng)相的影響，糖類在近紫外區(qū)190nm附近有吸收波長(zhǎng)（胞壁酸的最大吸收波長(zhǎng)是199nm），這些區(qū)域噪聲大，受溶劑雜質(zhì)影響大，宜采用柱后衍生紫外-可見檢測(cè)器檢測(cè)。氣相色譜法具有靈敏度高、進(jìn)樣量少、分析速度快、成本低等優(yōu)點(diǎn)。采用氣相色譜法測(cè)定胞壁酸，遇到的問題是胞壁酸化合物

4、的沸點(diǎn)高，沒有足夠的揮發(fā)性，在進(jìn)行氣相色譜分析之前，將胞壁酸轉(zhuǎn)化生成易揮發(fā)、對(duì)熱較穩(wěn)定的衍生物。
　　目的：本實(shí)驗(yàn)旨在摸索一種以豐富的谷氨酸棒狀桿菌菌渣為原料水解提取胞壁酸的方法，采用GC-MS、質(zhì)譜和HPTLC對(duì)樣品進(jìn)行胞壁酸的定性，且用HPTLC掃描斑點(diǎn)定量。簡(jiǎn)化胞壁酸的提取工藝流程，對(duì)提純的胞壁酸樣品甲醇溶液進(jìn)行光譜掃描，結(jié)晶進(jìn)行顯微鏡觀察晶體外形，進(jìn)一步了解胞壁酸的性質(zhì)。
　　方法：谷氨酸棒狀桿菌菌渣的胞壁酸的提取：

5、菌渣經(jīng)過蒸餾水洗滌，三氯乙酸除去磷壁酸裂解菌體，鹽酸水解，酸解菌渣后，在樣品的提取除雜過程中，先用氯仿和水分液，再用糖用活性炭吸附有色物質(zhì)等雜質(zhì)，甲醇或乙醇提取，調(diào)PH值至6.6~6.8，粗樣直接進(jìn)行HPTLC檢測(cè)或衍生生成糖腈乙酸酯衍生物進(jìn)行氣質(zhì)分析，活性炭柱色譜分離胞壁酸樣品后，進(jìn)行質(zhì)譜分析。
　　對(duì)于胞壁酸的關(guān)鍵工藝步驟—水解選擇的酸、酸解時(shí)間、料液比、酸解濃度、溫度進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)得到最佳實(shí)驗(yàn)方案。對(duì)胞壁酸總體提取工藝進(jìn)行簡(jiǎn)

6、化，減少胞壁酸提取步驟。經(jīng)過柱色譜分離純化胞壁酸樣品，HPTLC檢測(cè)提取胞壁酸的純度。對(duì)胞壁酸性質(zhì)的研究主要對(duì)胞壁酸的甲醇溶液進(jìn)行光譜掃描，了解它的最大吸收波長(zhǎng)和特征吸收峰；通過顯微鏡觀察胞壁酸樣品晶體的外形。
　　結(jié)果:埃希克試劑使樣品呈玫紅色；在氣質(zhì)聯(lián)用分析中，檢測(cè)到和胞壁酸相連的葡萄糖胺；通過高效薄層層析檢測(cè)，同一Rf值中，樣品中有和胞壁酸顏色相同的斑點(diǎn)，經(jīng)全反射吸收波長(zhǎng)掃描，發(fā)現(xiàn)斑點(diǎn)和胞壁酸的曲線一致，我們可以推測(cè)樣品中含

7、有胞壁酸或者胞壁酸衍生物，后把這一斑點(diǎn)用柱色譜分離純化，質(zhì)譜分析檢測(cè)得到相對(duì)分子質(zhì)量251.3，此物質(zhì)是胞壁酸。分離胞壁酸通過混合展開劑：采用兩種展開劑—甲醇/丙酮/水/乙酸/異丙醇（5：3：1：1：1，v/v）和冰乙酸/正丁醇/水（1:4:5，v/v），兩種染色方法—茚三酮乙醇試劑和苯胺-鄰苯二甲酸試劑，二次展開，其Rf值為0.84±0.01和0.60±0.02，薄層掃描儀在492nm/365nm吸收波長(zhǎng)掃描，進(jìn)行定性和定量，HPTL

8、C掃描對(duì)實(shí)驗(yàn)方法考察，日內(nèi)變異為2.2396％-3.5324%（RSD），日間變異為2.6545%-3.70534%（RSD）,其平均回收率為97.22%，檢測(cè)菌渣中胞壁酸的含量是11.05192mg/g。
　　最佳提取工藝：酸解→脫色→乙醇提取→HPTLC檢測(cè)→活性炭柱色譜分離→純度檢測(cè)，料液比是2，4mol/L的鹽酸在65℃水解6h，吸附糖用活性炭是菌渣質(zhì)量的0.1倍，活性炭在45℃水浴加熱吸附脫色。胞壁酸甲醇溶液最大吸收波長(zhǎng)