谷氨酸棒狀桿菌對(duì)芳香族化合物耐受機(jī)制研究.pdf

1、木質(zhì)纖維素主要由木質(zhì)素、半纖維素和纖維素三大成分組成，是地球上最豐富的可再生資源，也是生物煉制產(chǎn)業(yè)最可依賴的原料來(lái)源。因此關(guān)于木質(zhì)纖維素的高效利用技術(shù)（如五碳糖和六碳糖共利用技術(shù)、纖維素降解技術(shù)等）一直是生物煉制領(lǐng)域的重點(diǎn)攻關(guān)方向。通過(guò)多年研究，上述技術(shù)難題正逐步得到解決。而提高微生物細(xì)胞工廠對(duì)木質(zhì)纖維素糖化液中毒性生長(zhǎng)抑制物質(zhì)的耐受性是木質(zhì)纖維素高效利用領(lǐng)域的下一個(gè)研究熱點(diǎn)。在這些抑制物中，酚類物質(zhì)（如阿魏酸、香草醛、苯酚等）是其中的

2、主要抑制物之一。那么如何提高工業(yè)菌種對(duì)這些酚類物質(zhì)的耐受性，從而盡可能的減少其對(duì)工業(yè)菌種在發(fā)酵當(dāng)中的影響，就成為了急需解決的問(wèn)題。谷氨酸棒狀桿菌是重要的工業(yè)菌種，其在微生物發(fā)酵進(jìn)行氨基酸生產(chǎn)當(dāng)中發(fā)揮著重要的作用，特別是在工業(yè)中生產(chǎn)谷氨酸進(jìn)而生產(chǎn)味精的技術(shù)已經(jīng)被廣泛應(yīng)用。此外，其在木質(zhì)纖維素糖化液中的酚類芳香族化合物的降解及耐受方面比一般的工業(yè)菌種有著較好的“天賦”。因此本研究以谷氨酸棒桿菌為研究對(duì)象，使用基于Microarray的轉(zhuǎn)錄組

3、學(xué)和分子遺傳學(xué)相結(jié)合的方法，揭示了其對(duì)阿魏酸、香草醛和苯酚的耐受機(jī)制。主要結(jié)果如下:
　　1.揭示了谷氨酸棒桿菌對(duì)阿魏酸的耐受機(jī)制:(1)谷氨酸棒桿菌能夠降解阿魏酸（phdA-E、pcaGH、vanAB等降解相關(guān)基因上調(diào)），從而降低了生長(zhǎng)環(huán)境中阿魏酸的濃度，達(dá)到減輕其對(duì)細(xì)胞毒害的目的。(2)谷氨酸棒桿菌細(xì)胞被膜的復(fù)雜結(jié)構(gòu)具有比其他細(xì)菌更好的保護(hù)作用，并且參與合成細(xì)胞壁及膜蛋白的基因也有著差異化的表達(dá)來(lái)適應(yīng)阿魏酸脅迫。(3)谷氨酸棒

4、狀桿菌細(xì)胞生長(zhǎng)會(huì)放緩（參與復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和翻譯的基因表達(dá)下調(diào)），這樣可以減少阿魏酸對(duì)DNA、RNA和蛋白質(zhì)的損害。(4)谷氨酸棒狀桿菌細(xì)胞能激活各種防御及修復(fù)機(jī)制來(lái)應(yīng)對(duì)阿魏酸的影響（如誘導(dǎo)SOS反應(yīng)、產(chǎn)生Clp家族蛋白降解受損蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)修飾作用等）。通過(guò)進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)sigE和katA突變體對(duì)阿魏酸脅迫更敏感。
　　2.揭示了谷氨酸棒桿菌對(duì)香草醛的耐受機(jī)制:(1)谷氨酸棒桿菌能夠降解香草醛（vanAB、pcaBCH等降解相關(guān)基因

5、表達(dá)上調(diào)），從而降低了細(xì)胞周圍香草醛的濃度。(2)谷氨酸棒狀桿菌細(xì)胞被膜具有復(fù)雜的結(jié)構(gòu)，使其具有較好的保護(hù)作用。(3)在香草醛脅迫條件下，一些與應(yīng)激反應(yīng)相關(guān)基因的差異化表達(dá)可以減少對(duì)谷氨酸棒桿菌細(xì)胞的損傷。(4)通過(guò)核糖體/翻譯和蛋白質(zhì)分泌相關(guān)基因的差異化表達(dá)來(lái)應(yīng)對(duì)香草醛脅迫。還發(fā)現(xiàn)sigH和msrA突變體對(duì)香草醛脅迫更敏感。
　　3.揭示了谷氨酸棒桿菌對(duì)苯酚的耐受機(jī)制:(1)谷氨酸棒桿菌可以降解苯酚(phe、pcaDF等降解相關(guān)

6、基因表達(dá)上調(diào))，從而降低了細(xì)胞周圍苯酚的濃度。(2)谷氨酸棒桿菌通過(guò)減慢細(xì)胞生長(zhǎng)代謝速度來(lái)減少苯酚對(duì)生物大分子的損害（復(fù)制、翻譯和轉(zhuǎn)錄相關(guān)的基因表達(dá)下調(diào)）。(3)谷氨酸棒桿菌的細(xì)胞被膜較復(fù)雜，保護(hù)作用比較強(qiáng)。(4)谷氨酸棒狀桿菌能誘導(dǎo)保護(hù)和修復(fù)相關(guān)機(jī)制以適應(yīng)苯酚的脅迫（誘導(dǎo)熱休克反應(yīng)、產(chǎn)生伴侶蛋白以幫助蛋白質(zhì)折疊等）。而進(jìn)一步的試驗(yàn)結(jié)果表明，groEL突變體對(duì)苯酚脅迫更敏感。
　　4.通過(guò)分析谷氨酸棒桿菌對(duì)阿魏酸、香草醛及苯酚響應(yīng)

7、的Microarray數(shù)據(jù)，重點(diǎn)研究了在三個(gè)Microarray數(shù)據(jù)中都有著差異化表達(dá)的基因。差異化表達(dá)基因數(shù)總共有140個(gè)（73個(gè)上調(diào)，67個(gè)下調(diào)）。通過(guò)STRING數(shù)據(jù)庫(kù)的分析，得到差異化表達(dá)基因所編碼蛋白的相互作用網(wǎng)絡(luò)，再經(jīng)分析得到5個(gè)重要的節(jié)點(diǎn)蛋白(NCgl2553、NCgl1897、NCgl2586、NCgl0802、NCgl0882)。通過(guò)代謝途徑分析等方法進(jìn)行進(jìn)一步分析，發(fā)現(xiàn)差異化表達(dá)基因多集中于與碳源利用相關(guān)途徑和細(xì)胞膜