異源表達(dá)埃倫柱孢谷氨酸脫氫酶基因CeGDH對(duì)水稻氮素利用的影響.pdf

1、谷氨酸脫氨酶(GDH)普遍存在于生物體內(nèi)，能夠?qū)H4+氨化成谷氨酸，實(shí)現(xiàn)對(duì)氮素的固定。由于植物中的GDH對(duì)NH4+的親和力比較低，所以植物主要是通過GS/GAGT途徑實(shí)現(xiàn)對(duì)氮素的固定。微生物的GDH比植物的GDH對(duì)NH4+有更高的親和力，在其氮代謝中起著重要作用。研究表明將某些微生物的GDH異源表達(dá)到植物中，能促進(jìn)植物的氮素利用率提高?；谒臼侨虬霐?shù)以上人的主食，將微生物GDH異源表達(dá)到水稻中，對(duì)解決糧食問題起重要作用。本文為研究

2、真菌埃倫柱孢GDH基因CeGDH做了如下研究，主要的研究結(jié)果如下:
　　1.生物信息學(xué)分析表明真菌埃倫柱孢（Cylindrocarponehrenbergii）中的NADP(H)依賴的谷氨酸脫氫酶CeGDH與水稻和擬南芥的GDH氨基酸同源性比較低，卻與黑曲霉（Aspergillusniger）的gdhA以及中間脈孢霉（Neurosporaintermedia）的NiGDH的氨基酸同源性比較高。
　　2.成功克隆了CeGDH并

3、將其表達(dá)到水稻中(Oryzasativacv.Kitaake)。構(gòu)建原核表達(dá)載體pCold-TF-CeGDH，通過IPTG誘導(dǎo)，得100KD重組蛋白。用純化獲得的CeGDH蛋白檢測(cè)NADP(H)-GDH體外表達(dá)酶活。結(jié)果表明CeGDH氨化反應(yīng)的酶活(3.24μmolmin-1mg-1)大于去氨化反應(yīng)的酶活(0.28μmolmin-1mg-1)。
　　3.構(gòu)建了亞細(xì)胞定位載體35∷CeGDH-YFP，將重組載體瞬時(shí)表達(dá)到擬南芥原生質(zhì)

4、體中，結(jié)果顯示CeGDH-YFP是在氮素同化的場(chǎng)所細(xì)胞胞質(zhì)中表達(dá)。
　　4.構(gòu)建的植物過表達(dá)載體pCAMBIA1301GW-CeGDH，通過農(nóng)桿菌侵染方法轉(zhuǎn)入水稻。用半定量以及WesternBlotting方法對(duì)轉(zhuǎn)基因進(jìn)行鑒定。
　　5.提取轉(zhuǎn)基因植株（Ubi∷CeGDH-7和Ubi∷CeGDH-33）和WT植株的總蛋白，用于測(cè)定轉(zhuǎn)基因水稻體內(nèi)的酶活。結(jié)果發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因株系酶活和體外酶活的結(jié)果相一致。NADPH依賴的酶活顯示W(wǎng)T

5、，Ubi∷CeGDH-7，Ubi∷CeGDH-33的氨化反應(yīng)酶活分別為0.277，0.310，0.337μmolmin-1mg-1，去氨化反應(yīng)分別為0.0452，0.0217，0.0250μmolmin-1mg-1。說明在CeGDH傾向于將酮戊二酸轉(zhuǎn)化為谷氨酸。
　　6.水培實(shí)驗(yàn)表明與野生型WT相比，低氮濃度下的轉(zhuǎn)基因水稻苗期的苗長根長以及氮素含量都明顯高于WT。田間農(nóng)藝學(xué)性狀統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，低氮梯度下轉(zhuǎn)基因株系的有效穗和單株重相比