環(huán)境應(yīng)答基因JWA對谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)的影響.pdf

1、該研究旨在探討JWA蛋白與谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)的關(guān)系及其可能的機(jī)制,并進(jìn)一步研究JWA參與調(diào)節(jié)環(huán)境污染物農(nóng)藥氰戊菊酯對細(xì)胞內(nèi)氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)的影響.為研究JWA基因?qū)劝彼徂D(zhuǎn)運(yùn)的影響,用pCMV<,2>-flag-JWA載體轉(zhuǎn)染的HEK293細(xì)胞,建立JWA高表達(dá)模型;用反義寡核苷酸技術(shù)抑制細(xì)胞內(nèi)JWA表達(dá),建立JWA低表達(dá)模型;用激光共聚焦顯微鏡檢測細(xì)胞內(nèi)Ca<'2+>的含量,用免疫熒光和Western blot法檢測細(xì)胞內(nèi)JWA蛋白的分布和表達(dá)水平

2、.摻入[<'3>H]-D,L-谷氨酸為標(biāo)志物觀察JWA基因?qū)?xì)胞攝取谷氨酸的影響.根據(jù)JWA基因編碼氨基酸的磷酸化位點(diǎn)的位置,分別構(gòu)建了四個含不同長短JWA編碼區(qū)多肽片段的pEGFP表達(dá)載體,轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞后,在活細(xì)胞觀察佛波酯(PMA)對JWA表達(dá)和細(xì)胞內(nèi)定位的影響.用不同濃度結(jié)果表明:JWA基因高表達(dá)的細(xì)胞攝取谷氨酸增加,用反義寡核苷酸關(guān)閉JWA后,谷氨酸攝取下降.PMA可增加細(xì)胞谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn),轉(zhuǎn)染JWA對PMA引起的細(xì)胞谷氨酸

3、攝取無顯著影響.PMA還引起HEK293細(xì)胞內(nèi)游離鈣濃度一過性升高.PMA使轉(zhuǎn)染pEGFP-JWA的HEK293細(xì)胞內(nèi)JWA表達(dá)升高,細(xì)胞內(nèi)定位發(fā)生改變.用不同濃度的氰戊菊酯處理PC12細(xì)胞后發(fā)現(xiàn)可誘導(dǎo)JWA基因表達(dá)升高,并在一定濃度時促進(jìn)細(xì)胞的谷氨酸攝取,提示該基因可能在細(xì)胞應(yīng)答環(huán)境污染物對神經(jīng)遞質(zhì)的影響中發(fā)揮作用.JWA蛋白通過非PKC途徑增強(qiáng)HEK293細(xì)胞谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)功能,增強(qiáng)谷氨酸介導(dǎo)的神經(jīng)興奮傳遞,參與中樞神經(jīng)系統(tǒng)病變,因而可