不同來源的艱難梭菌其毒素、MLST分型及藥敏情況的分析.pdf

1、目的：
　　為了了解不同來源的艱難梭菌在MLST分型、毒素基因表達及其調(diào)控方面的差異，我們對來源于成人和嬰幼兒的艱難梭菌菌株進行相應(yīng)的研究，同時了解這些菌株對目前CDI治療常用抗菌藥物的敏感性及其耐藥基因產(chǎn)生的情況。
　　方法：
　　收集2014年3月至2015年4月，來源于廣州軍區(qū)廣州總醫(yī)院住院患者有腹瀉癥狀的成人糞便標(biāo)本675份、及廣東省婦幼保健院健康嬰幼兒（＜2歲）糞便標(biāo)本618份。將新鮮糞便接種于平板培養(yǎng)基上在

2、35℃溫箱厭氧孵育48h，挑選可疑菌落進行兩次耐氧試驗后通過API20A厭氧鑒定條進行鑒定或擴增艱難梭菌16srRNA特異性片段加以鑒定。16srDNA引物根據(jù)NCBI艱難梭菌參考菌株630設(shè)計。通過PCR方法鑒定所有菌株毒素基因的tcdA、tcdB。同時對毒素基因陽性的菌株進行MLST分型，根據(jù)Griffiths設(shè)計的七對看家基因引物測序，將每一份樣品中測定的7管家基因序列（adk、atpA等）提交到公用數(shù)據(jù)庫(http:/pubml

3、st.Org/Clostridium difficile)中比對，獲得相應(yīng)的等位基因譜，然后將等位基因圖譜提交到科克大學(xué)的公開數(shù)據(jù)庫（http://mlst.ucc.ie/mlst/）獲得ST型，若數(shù)據(jù)庫中不存在的型別認為是新的ST型。將7個等位基因的序列合并成1個大序列，使用clustalx軟件將64個樣品的序列進行Alignment對齊，然后在MEGA7.0上使用Maximum likelihood(ML)法構(gòu)建進化樹。
　　

4、對莫西沙星耐藥的菌株進行氟喹諾酮耐藥決定區(qū)基因的檢測，按照DeniseDrudy[8]等的方法通過PCR檢測DNA旋轉(zhuǎn)酶亞單位gyrA和gyrB基因。所得DNA序列采用Clustal X進行比對。
　　采用高通量測序的方法檢測9株A-B+菌株的SNPs數(shù)，分析突變位點，同時看菌株上是否存在大環(huán)內(nèi)酯類、林可霉素類、鏈霉素(MLS)的耐藥基因ermB和利福平耐藥基因rpoB是否存在突變。
　　結(jié)果：
　　從675份腹瀉癥狀

5、的成人糞便樣本中，共培養(yǎng)出艱難梭菌57株，從618份嬰幼兒糞便標(biāo)本中共分離到艱難梭菌65株。將所有確認為艱難梭菌的菌株進行毒素基因tcdA/tcdB擴增，成人分離到的57株艱難梭菌，有毒素基因的有37株，陽性率為64.91％;兒童共分離到艱難梭菌65株，其中毒素基因陽性的30株，陽性率為46.15％。在毒素基因陽性（即含毒株）中，有A/B毒素均為陽性的(86.57％)，也有不含A毒素只含B毒素的，占含毒株的13.43％。MLST分析顯示

6、，成人37株含毒菌株共分出11個ST型，兒童27株含毒菌株共分出9個ST型，另外兩個沒有分到ST型，可能是新的ST型。同時發(fā)現(xiàn)成人及兒童艱難梭菌MLST分型排名前三位均為相同ST分型，兩組間雖然有部分ST分型不同，但大部分相同。為了方便統(tǒng)計將兩組間不同的ST分型歸為一個“其他分型”，結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩組間的ST分型分布沒有統(tǒng)計學(xué)差異。進化樹和聚類結(jié)果可以看出兩組數(shù)據(jù)呈離散分布，并未根據(jù)人群分組出現(xiàn)明顯聚類的現(xiàn)象。
　　通過對67株含毒基因

7、的艱難梭菌進行AB毒素的測定，發(fā)現(xiàn)成人組中，37株含毒株有33株可檢測得到毒素，陽性率為89.19％;而在兒童組中，30株含毒株僅有17株能檢測得到毒素，陽性率為56.67％。兒童組有9株是介于陰性和陽性之間的灰色區(qū)域，而成人組中只有3株。陰性區(qū)成人(2.7％)與兒童(13.33％)也有顯著差異。通過統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)兩組間的毒素檢測情況存在顯著的差異(P=0.003)。細胞毒素驗證試驗:采用腦心浸液厭氧培養(yǎng)48h后，離心收集上清用0.45μm和

8、0.22μm的過濾器過濾除菌，再與Vero細胞共培養(yǎng)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)成人的菌液上清作用于細胞后，細胞出現(xiàn)皺縮，變圓，甚至不貼壁漂浮起來;而與兒童菌液上清作用后，細胞并無明顯變化。
　　從測序結(jié)果看到，9株A-B+型菌株在致病區(qū)域與A+B+參考基因組630相比存在較多的突變，尤其是在TcdB的N端前940個氫基酸。通過SNPs搜索發(fā)現(xiàn)（參考菌株M68），9株艱難梭菌有20個相同的突變，所有菌株從基因角度上均是相互獨立的(＞10 SNPs)

9、。9株菌株均有檢測到ermB的序列，但與利福平耐藥相關(guān)的rpoB基因沒有檢測到突變，與藥敏結(jié)果相符。
　　結(jié)論：
　　本研究從675份腹瀉癥狀的成人糞便樣本中，共培養(yǎng)出艱難梭菌57株，含有毒素基因的37株(64.91％)，從618份嬰幼兒糞便標(biāo)本中共分離到艱難梭菌65株，含有毒素基因的30株(46.15％)。說明嬰幼兒中艱難梭菌還是以非產(chǎn)毒株居多。在毒素基因陽性（即含毒株）中，有不含A毒素只含B毒素的，即A-B+菌株。A-B

10、+菌株雖然缺乏A毒素，但仍報道出現(xiàn)嚴(yán)重的CDAD且有爆發(fā)流行。A-B+菌株歐美的分離率偏低，亞洲檢出率較高，中國報道檢出率達到23.2％～48％，而本研究中A-B+的總體檢出率比例為13.4％，成人檢出率13.5％(5/37)與兒童的13.3％(4/30)無明顯差異，低于全國報道。
　　從tcdC的測序結(jié)果看到，67株含毒菌株有38株是與參考菌株630相比沒有任何突變，29株出現(xiàn)點突變，沒有發(fā)現(xiàn)任何缺失片段。在29株出現(xiàn)突變的菌株

11、中，共分為3種類型:第一種是(Asp7 to Glu);第二種是(Asp7 to Glu)+(Ala50to Ser);第三種是(Asp7 to Glu)+(Ala36 to Val)+(Glu57to Lys)。兩組間共有9株菌出現(xiàn)第三種6個位點的突變，而這9株菌恰好都是A-B+株，都屬于ST37型，或許tcdC的突變也伴隨這tcdA的突變，但之間的內(nèi)在聯(lián)系未見報道。這三種突變情況在成人和兒童組中均有出現(xiàn)，兩組間的突變情況沒有統(tǒng)計學(xué)差

12、異。有突變的菌株會出現(xiàn)沒有檢測到AB毒素的情況，而AB毒素陽性的很多菌株也是tcdC沒有任何突變的，因而，從本實驗看來，tcdC的突變與AB毒素表達不呈現(xiàn)負相關(guān)性。那么兒童毒素表達較成人弱或與tcdC負調(diào)控基因的突變沒有關(guān)系，是什么影響著兒童攜帶的艱難梭菌AB毒素的表達？另外，本研究只采用免疫熒光方法檢測菌株產(chǎn)生的AB毒素，其他檢測毒素的方法是否會有同樣的結(jié)果呢？
　　細胞毒素試驗是檢測毒素的金標(biāo)準(zhǔn)，我們選取成人中三株CDAB陽性

13、的，和兒童含毒株中三株CDAB陰性的菌株模擬細胞毒性試驗。結(jié)果發(fā)現(xiàn)成人的菌液上清感染細胞后，細胞出現(xiàn)皺縮，變圓，甚至不貼壁漂浮起來;而兒童菌液上清作用后，細胞并無明顯變化。說明成人菌株與兒童菌株確實在表達毒素方面存在差異。
　　本研究測定89株艱難梭菌的MIC，發(fā)現(xiàn)甲硝唑、萬古霉素、替加環(huán)素、替考拉寧的MIC范圍均比較低，敏感性好，但有16株菌對莫西沙星出現(xiàn)耐藥(17.9％)。在全國看來這個耐藥率并不算高，2010李玉強檢測20株

14、艱難梭菌，對莫西沙星耐藥率為35％，而2011年黃海輝等人報道的188例艱難梭菌莫西沙星耐藥率為50％。雖然本研究中莫西沙星耐藥率不高，但16株莫西沙星耐藥的菌株，全部都是表現(xiàn)為高度耐藥(MIC＞32μg/ml).耐藥基因測序結(jié)果發(fā)現(xiàn)有15株均在GyrA和GyrB存在1-2個氨基酸突變，有一株是沒有任何堿基突變的。已將確認與莫西沙星耐藥相關(guān)的GyrA(Thr82 to Ile)是最常見的，有12株之多。而GyrB上，Asp426 to

15、Asn屬于有報道過的突變位點，卻只出現(xiàn)在一株菌上，其余的Val130-Ile，Ser366-Ala，Asp465-Asn都是未見報道，但含有以上突變的大部分同時伴隨了GyrA(Thr82 to Ile)，因而很難說明這些突變的確切意義。僅有兩株高度菌是單一的未見報道的GyrB突變，其意義有待考究。同時對所有A-B+菌株gyrA或gyrB進行了測序，結(jié)果發(fā)現(xiàn)本實驗發(fā)現(xiàn)中兩株對莫西沙星表現(xiàn)出高度耐藥(MIC＞32μg/ml)的卻沒有在gyr

16、A上有突變位點，僅有一株在gyrB上有一個位點突變(Asp465-Asn)，但該位點未報道，是否與莫西沙星耐藥相關(guān)還有待驗證。另外，比較常見的確認是與莫西沙星耐藥有關(guān)的gyrA的突變位點Thr82 to Ile卻出現(xiàn)在在兩株莫西沙星敏感的菌株上;而有一株對莫西沙星高度耐藥的菌在QRDR沒有任何突變。這個現(xiàn)象也并非我們首次發(fā)現(xiàn)，可能gyrA或gyrB上位點突變可能與莫西沙星相關(guān)性較低，又或者艱難梭菌對氟喹諾酮類藥物的耐藥與QRDR的突變不

17、存在必然的聯(lián)系。
　　從測序結(jié)果看到，這9株A-B+型菌株與A+B+參考基因組630相比，不僅是tcdA有較大差異，毒素B的編號基因tcdB也有較多的突變，尤其是在N端前940個氨基酸，說明確實A毒素的菌株在B毒素調(diào)控表達方面也是存在差異的。通過SNPs搜索發(fā)現(xiàn)（參考菌株M68），9株艱難梭菌有20個相關(guān)的突變，大部分突變是無義突變，而有義突變包括缺失、終止子的獲得或缺失、上下游基因的突變等。所有菌株從基因角度上均是區(qū)別獨立的(＞