不同來源單核細(xì)胞增生性李斯特菌分離株的分子亞分型研究.pdf

1、單核細(xì)胞增生性李斯特菌（Listeria monocytogenes, Lm）是重要的人獸共患李斯特菌病的病原菌，能引起腦膜炎、胃腸炎、敗血癥及流產(chǎn)等癥狀，死亡率高達(dá)20％-30％，是致死率最高的食源性病原菌。動物李斯特菌病主要與動物食用污染的貯存飼料有關(guān)。該菌通過污染農(nóng)場和經(jīng)食品加工環(huán)節(jié)傳染給人。李斯特菌病在歐美國家曾多次暴發(fā)流行，其中不少為動物制品污染Lm所致。我國也有Lm在畜禽和人之間引起暴發(fā)的報道。Lm對人類健康造成極大的威脅，

2、已引起世界各國的高度重視。
　　本研究對華東地區(qū)食品中Lm污染狀況進(jìn)行了調(diào)查，并對分離和收集的食品源、動物源和人源菌株進(jìn)行基于多位點序列分型(Multilocus Sequence Typing，MLST)的遺傳進(jìn)化分析，以及基于毒力基因及毒力相關(guān)基因的遺傳譜系分析和多毒力位點序列分型(Multi-Virulence-Locus Sequence Typing，MVLST)分析，根據(jù)以上菌株的分離背景，結(jié)合小鼠感染實驗，對引起李斯

3、特菌病的臨床分離株和食品源分離株的種群結(jié)構(gòu)、毒力進(jìn)化及侵襲力進(jìn)行了研究。
　　1食品中單核細(xì)胞增生性李斯特菌的分離和鑒定
　　對華東地區(qū)11個城市的豬肉、雞肉、牛肉、海產(chǎn)品、RTE和蔬菜共六類食品進(jìn)行了Lm的分離和鑒定。對采集的樣品先用LEB培養(yǎng)基進(jìn)行選擇性增菌，再用科馬嘉李斯特菌顯色培養(yǎng)基進(jìn)行鑒別，將分離獲得的可疑細(xì)菌利用多重PCR進(jìn)行李斯特菌屬和種的鑒定，最后以鑒定血清型的多重PCR和Lm李斯特菌診斷血清聯(lián)合使用確定Lm

4、的血清型。在采集的11個城市的538份樣品中，共分離到93株Lm、150株無害李斯特菌(L.innocua)和4株威氏李斯特菌（L.welshimeri）。Lm分離率為17.29％，其中包括46株血清型為1/2a的菌株、16株血清型為1/2b的菌株、30株血清型為1/2c的菌株和1株血清型為4b的菌株。對六大類食品的Lm分離結(jié)果表明，華東地區(qū)11個城市食品中Lm分離率較高，Lm分離株的優(yōu)勢血清型為1/2a，1/2b和1/2c;冷凍和冷鮮

5、樣品中的Lm分離率明顯高于常溫下的樣品(P＜0.05);此外，豬肉、雞肉和牛肉等生肉中Lm分離率較高，生肉及冷凍和冷鮮食品中Lm分離率高于常溫貯存的樣品。華東地區(qū)食品中的李斯特菌分離結(jié)果顯示，食品中存在一定程度的Lm的污染，對食品安全造成了威脅，食品加工、流通和銷售環(huán)節(jié)的監(jiān)控有待加強。
　　2不同來源單核細(xì)胞增生性李斯特菌分離株的MLST分型研究
　　MLST是一種基于多個管家基因序列的分型方法，適合進(jìn)行種群結(jié)構(gòu)分析和進(jìn)化分

6、析。為了研究不同分離來源和不同血清型菌株的種群結(jié)構(gòu)，本研究對分離的Lm菌株進(jìn)行了MLST分型，繪制了最小生成樹(Minimum spanning tree)。MLST結(jié)果顯示，64株菌株分為25個ST型，其中ST618、ST619和ST626為新申請的ST型。ST型與血清型有較高的相關(guān)性，大多數(shù)ST型對應(yīng)一個血清型，如ST3、ST5和ST87型;也有一個ST型對應(yīng)多個血清型，如ST1、ST3和ST9等包含多個血清型。此外，出現(xiàn)了3個克隆

7、復(fù)合群(Clonalcomplex，CC) CC1、CC3和CC9，這三個克隆復(fù)合群在其他國家和地區(qū)也廣泛分布。另外，人和動物源分離株分布在多個ST型中，其中多株人源株分離株分布在CC9中。CC9中也包括許多食品源分離株。從進(jìn)化距離可以看出，血清型1/2a和1/2c，血清型1/2b與4b、4d、4e間分別存在較近的遺傳關(guān)系。血清型1/2b與4b間出現(xiàn)“間隔式”進(jìn)化，而血清型1/2a和1/2c間則出現(xiàn)“遞進(jìn)型”進(jìn)化?？傊?，通過MLST分型

8、，了解了食品源分離株的ST型分布，發(fā)現(xiàn)不同來源菌株中某些占優(yōu)勢的ST或CC，研究了不同血清型的進(jìn)化關(guān)系。
　　3基于毒力及毒力相關(guān)基因序列的分子亞分型研究
　　本研究基于毒力基因actA的3'端高度變異的序列，對食品源、動物源和人源分離株進(jìn)行了遺傳譜系(lineage)分析。結(jié)果表明，把Lm分離株共分為了四個譜系，其中絕多數(shù)分離株屬于lineageⅠ和lineageⅡ。LineageⅠ主要包括血清型1/2b、4b和部分4d、

9、4e菌株。LineageⅡ主要包括血清型1/2a和1/2c菌株。血清型4b菌株分布在lineageⅠ、Ⅲ和Ⅳ中。四個譜系的菌株在生態(tài)學(xué)、遺傳學(xué)和表型特征上有明顯差異，與Lm在食品中的傳播能力和致病性有著密切的關(guān)系。
　　MLST由于管家基因的保守性，不適合局部流行病學(xué)研究，對某些血清型分辨力不足。因此利用基于毒力基因的MVLST和小鼠感染實驗進(jìn)一步研究了菌株的毒力基因進(jìn)化和毒力潛能。通過MVLST分析發(fā)現(xiàn)，血清型4b和1/2b的菌

10、株分別屬于兩個不同的簇(Cluster)Cluster A和Cluster B。血清型4b菌株又分為兩個亞簇，其中一個亞簇由多株人源和動物源臨床菌株構(gòu)成，除血清型4b菌株之外，還包括血清型4d、4e、3b和1/2b的菌株;另一個血清型4b亞簇全部由血清型4b的菌株構(gòu)成，但多為食品源分離株。血清型1/2a和1/2c菌株在MVLST中仍未完全分開，表明兩種血清型具有高度同源性。通過MVLST分型表明不同血清型已經(jīng)出現(xiàn)不同的毒力基因特征，而各

11、血清型內(nèi)部也有不同的毒力基因特征。選取部分Lm菌株以尾靜脈注射途徑進(jìn)行的小鼠感染實驗表明，不同血清型菌株的侵襲能力不同，對內(nèi)臟器官造成的病理變化程度也不同，其中血清型1/2a的菌株侵襲能力最強，1/2c的菌株次之，血清型1/2a的菌株與1/2b和4b菌株的侵襲能力呈現(xiàn)顯著性差異(P＜0.05)。從不同角度進(jìn)行的三種分子亞分型的實驗結(jié)果顯示了血清抗原相關(guān)基因、管家基因、和毒力及毒力相關(guān)基因在某種程度上呈現(xiàn)進(jìn)化一致性。
　　綜上所述，