趨化因子受體CCR5、CCR6、CXCR3在不同人舌鱗癌細胞株的表達及其配體MIP-1β、MIP-3α、IP-10對人舌鱗癌細胞CAL-27增殖、凋亡及侵襲作用的影響.pdf

1、背景:
　　 口腔鱗狀細胞癌(oral squamous cell carcinoma，OSCC)是一種常見的頭頸部惡性腫瘤，其中舌鱗狀細胞癌（tongue squamous cell carcinoma，TSCC）發(fā)病率最高(約占OSCC的25％-40％)，具有高侵襲性的生長方式和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的特征。盡管癌癥的治療已經(jīng)取得了重大進展，但從20世紀60年代至今，OSCC的死亡率基本保持不變，5年生存率徘徊在50％左右，復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移仍

2、是影響預(yù)后的重要因素。然而腫瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移是個復(fù)雜的過程，這不僅依賴于腫瘤細胞內(nèi)在的特征，還依賴于腫瘤所處微環(huán)境的一些因素。
　　 早在1979年，Lord就提出了腫瘤微環(huán)境的概念，即指腫瘤在其發(fā)生過程中的內(nèi)環(huán)境，由腫瘤細胞本身、間質(zhì)細胞、微血管、組織液及少量浸潤細胞共同組成的一個復(fù)雜的集合系統(tǒng)。間質(zhì)細胞和癌細胞之間可以相互誘導(dǎo)、相互作用，以利于腫瘤的增殖和侵襲。
　　 然而，在腫瘤微環(huán)境中常常存在著慢性炎癥，這種炎癥多

3、數(shù)是由感染、低氧、低PH、高壓等特性引起。存在大量的生長因子、細胞趨化因子和多種蛋白水解酶，所產(chǎn)生的免疫炎性反應(yīng)有利于腫瘤的增殖、侵襲、粘附、血管生成以及對放、化療的抵抗，促使惡性腫瘤產(chǎn)生和發(fā)展。
　　 不難發(fā)現(xiàn)，在對腫瘤微環(huán)境研究的很多方面都滲透著腫瘤與炎癥的聯(lián)系，腫瘤與炎癥的關(guān)系已經(jīng)成為腫瘤研究的新方向，腫瘤炎癥微環(huán)境的研究已經(jīng)成為當今腫瘤研究的熱點。我們在前期實驗中利用高通量、精確的蛋白質(zhì)芯片技術(shù)（抗炎癥因子芯片）對3種不

4、同侵襲能力的人舌鱗癌細胞(UM-1、CAL-27、Tca-8113)和人正?？谇火つど掀ぜ毎囵B(yǎng)上清中的炎癥因子進行了初步篩選后發(fā)現(xiàn)，與侵襲性相對較低腫瘤細胞(Tca-8113)和正?？谇火つぜ毎啾龋奘杉毎装Y蛋白-1β(MIP-1β)、巨噬細胞炎癥蛋白-3α（MIP-3α）、干擾素誘導(dǎo)蛋白-10（IP-10）在侵襲性相對較高的腫瘤細胞株(UM-1、CAL-27)中高表達。然而，在人舌鱗癌腫瘤細胞中MIP-1β、MIP-3α、IP-

5、10相關(guān)受體CCR5、CCR6、CXCR3的表達國內(nèi)外尚未見文獻報道，MIP-1β/CCR5、MIP-3α/CCR6、IP-10/CXCR3軸在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中的具體機制還不清楚。
　　 MIP-1β、MIP-3α、IP-10都是趨化因子超家族成員，能夠趨化細胞的定向運動?，F(xiàn)在越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤細胞可以自分泌某些趨化因子，通過促進腫瘤細胞增殖，瘤內(nèi)新生血管的生成，細胞外基質(zhì)蛋白酶的分泌，或者抑制機體的抗腫瘤免疫，促進

6、腫瘤生長、侵襲和轉(zhuǎn)移。趨化因子和其相應(yīng)的受體相互作用，在抗腫瘤的免疫、腫瘤的形成和轉(zhuǎn)移等方面發(fā)揮著廣泛的生理和病理作用。而在舌鱗癌中關(guān)于MIP-1β/CCR5、MIP-3α/CCR6、IP-10/CXCR3的相關(guān)研究較少，其各自在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中的具體機制還不清楚。本實驗通過Western Blot和免疫熒光染色技術(shù)檢測CCR5、CCR6、CXCR3在3種人舌鱗癌細胞株的表達情況;通過CCK-8法分別檢測MIP-1β、MIP-3α

7、、IP-10對人舌鱗癌細胞CAL-27增殖的影響;通過Annexin V/PI雙染流式細胞儀分別檢測其對CAL-27細胞凋亡的影響;通過Transwell侵襲實驗及明膠酶譜實驗檢測其對CAL-27細胞侵襲性的影響，初步探討MIP-1β、MIP-3α、IP-10在舌鱗癌發(fā)生發(fā)展過程中的作用。
　　 研究內(nèi)容共分三章:第一章CCR5、CCR6、CXCR3在3種人舌鱗癌細胞株的表達;第二章MIP-1β、MIP-3α、IP-10對人舌鱗

8、癌細胞CAL-27增殖、凋亡影響的研究;第三章MIP-1β、MIP-3α、IP-10對人舌鱗癌細胞CAL-27侵襲性影響的研究。
　　 第一章、CCR5、CCR6、CXCR3在3種人舌鱗癌細胞株的表達
　　 目的:
　　 檢測在3種人舌鱗癌細胞株UM-1、CAL-27、Tca-8113中CCR5、CCR6、CXCR3蛋白的表達及定位。為體外探討MIP-1β、MIP-3α、IP-10對腫瘤細胞生物學行為的研究奠定基

9、礎(chǔ)。
　　 方法:
　　 取對數(shù)期生長良好的細胞用于實驗，分別采用Western blot和免疫熒光染色對3種人舌鱗癌細胞株UM-1、CAL-27、Tca-8113中CCR5、CCR6、CXCR3的表達進行檢測。
　　 結(jié)果:
　　 Western blot結(jié)果顯示CCR5、CCR6、CXCR3在3種人舌鱗癌細胞株均有表達，分別在40.524 k D、42.494 k D、40.660 k D處均可見蛋白

10、表達條帶。免疫熒光染色結(jié)果顯示CCR5、CCR6、CXCR3在3種人舌鱗癌細胞株的細胞膜及胞質(zhì)內(nèi)均有表達。
　　 第二章、MIP-1β、MIP-3α、IP-10對人舌鱗癌細胞CAL-27增殖、凋亡影響的研究
　　 目的:
　　 觀察MIP-1β、MIP-3α、IP-10對人舌鱗癌細胞CAL-27增殖、凋亡的影響。
　　 方法:
　　 1.取對數(shù)期生長良好的細胞，經(jīng)無血清培養(yǎng)同步化處理24h后用于實

11、驗。根據(jù)MIP-1β(MIP-3α、IP-10)刺激濃度的不同，實驗分別分為四組:對照組（0ng/mL組）、10ng/mL組、20ng/mL組、40ng/mL組。用CCK-8法分別檢測各實驗組和對照組在12h、24h、48h時，對CAL-27細胞增殖的影響。
　　 2.實驗分組同前，根據(jù)實驗分組分別加入0ng/mL、10ng/mL、20ng/mL、40ng/mL MIP-1β（MIP-3α、IP-10）處理24h，Annexin

12、 V/PI雙染流式細胞儀檢測CAL-27細胞的凋亡情況。
　　 結(jié)果:
　　 (1)和對照組相比，12h、24h時，10ng/mL、20ng/mL、40ng/mL的MIP-1β對CAL-27細胞均有促進增殖的作用(P值均小于0.05);48h時，10ng/mL、20ng/mL的MIP-1β對CAL-27細胞有促進增殖的作用(P值均小于0.05)，但40ng/mL MIP-1β對CAL-27細胞的增殖無影響(P＞0.05)

13、;24h時，40ng/mLMIP-1β組細胞凋亡率顯著高于對照組(P＜0.05);而10ng/mL、20ng/mLMIP-1β組細胞凋亡率和對照組之間無顯著性差異（P值均大于0.05）。
　　 (2)和對照組相比，12h、24h、48h時，10ng/mL、20ng/mL、40ng/mL的MIP-3α對CAL-27細胞均有促進增殖的作用(P值均小于0.05)，但各濃度之間沒有顯著性差異（P值均大于0.05）;24h時，各實驗組CA

14、L-27細胞凋亡率和對照組之間均無顯著性差異（P值均大于0.05）。
　　 (3)和對照組相比，12h時，10ng/mL、20ng/mL、40ng/mL的IP-10均能夠促進CAL-27細胞增殖(P＜0.05)，并且存在濃度依賴性;24h時，不同濃度的IP-10亦能夠促進CAL-27增殖(P＜0.05)，但濃度依賴性消失;在48 h時，只有40ng/mL的IP-10能夠促進CAL-27增殖（P＜0.05)，10ng/mL、20n

15、g/mL的IP-10對CAL-27細胞的增殖無促進作用(P＞0.05);當IP-10的刺激濃度為10ng/mL和20ng/mL時，隨著作用時間的延長，其增殖率下降，在48 h時對細胞增殖已無促進作用。24h時，各實驗組CAL-27細胞的凋亡率均明顯高于對照組（P值均小于0.05），但各濃度之間未見顯著差異（P值均大于0.05）。
　　 第三章、MIP-1β、MIP-3α、IP-10對人舌鱗癌細胞CAL-27侵襲性影響的研究

16、>　　 目的:
　　 觀察MIP-1β、MIP-3α、IP-10對人舌鱗癌細胞CAL-27侵襲性的影響。
　　 方法:
　　 1.本實驗采用Transwell侵襲實驗分別觀察對照組0ng/mL PBS和實驗組80ng/m LMIP-1β（MIP-3α、IP-10）對人舌鱗癌細胞CAL-27侵襲性的影響;
　　 2.采用明膠酶譜實驗分別驗證實驗組80ng/mL MIP-3α、IP-10對CAL-27細胞的

17、促侵襲效應(yīng)，并檢測處理24h后各組細胞培養(yǎng)上清中MMP-2、MMP-9的酶活性情況。以相同體積的PBS溶液設(shè)為陰性對照。
　　 結(jié)果:
　　 Transwell侵襲實驗結(jié)果顯示:80ng/mL MIP-3α、IP-10組CAL-27細胞的侵襲率顯著高于對照組（P均小于0.05），而80ng/mL MIP-1β組CAL-27細胞的侵襲率和對照組無顯著性差異(P＞0.05);明膠酶譜實驗結(jié)果顯示:80ng/mLMIP-3α、

18、IP-10組細胞培養(yǎng)上清中MMP-2、MMP-9的活性均顯著高于對照組(P均小于0.05)。
　　 全文結(jié)論:
　　 1.CCR5、CCR6、CXCR3在3種人舌鱗癌細胞株的細胞膜及胞質(zhì)中均有表達;
　　 2.MIP-1β對人舌鱗癌細胞CAL-27有促進增殖的作用，但相對較高濃度的MIP-1β對CAL-27的凋亡也有促進作用。隨著較高濃度MIP-1β作用時間的延長，促增殖作用在減弱，而這種減弱可能是由較高濃度MI