杜仲MEP途徑系列基因全長cDNA分離鑒定及序列特征研究.pdf

1、杜仲（Eucommia ulmoides Oliv.）是我國特有的第三紀(jì)孑遺植物，也是優(yōu)良的溫帶膠源樹種和名貴藥用樹種。杜仲萜類化合物廣泛應(yīng)用于人們生產(chǎn)生活，其中最為重要的是杜仲膠和環(huán)烯醚萜類。2-甲基-D-赤蘚醇-4-磷酸（2-C-methyl-D-erythritol-4-phosphate，MEP）途徑是植物萜類生物合成上游重要的調(diào)控路徑之一。本研究以杜仲葉片轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)，分離鑒定MEP途徑所有相關(guān)酶高表達(dá)水平基因的cDN

2、A全長，并利用生物信息學(xué)方法對序列特征、結(jié)構(gòu)特點及基因功能進(jìn)行分析和預(yù)測，旨為潛在功能基因的篩選和挖掘，合成途徑中限速步驟的深入探究以及為萜類代謝工程靶點的確定和基因改良育種提供基礎(chǔ)信息。
　　1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸合成酶DXS是MEP途徑中的第一個關(guān)鍵酶，在杜仲中發(fā)現(xiàn)兩個DXS酶基因家族成員，分別命名為EuDXS1和EuDXS2。EuDXS1基因cDNA全長2805 bp，5’端非編碼區(qū)長218 bp，3’端非編碼區(qū)長4

3、48 bp，編碼712個氨基酸，與美麗帽柱木DXS基因序列相似性最高，達(dá)81％；EuDXS2基因cDNA全長2552 bp，5’端非編碼區(qū)長73 bp，3’端非編碼區(qū)長337 bp，編碼713個氨基酸，與橡膠DXS基因序列相似性最高，達(dá)82%。推導(dǎo)EuDXS1與EuDXS2氨基酸序列中均包含轉(zhuǎn)運肽序列（A1-A18；A1-A34）、TPP結(jié)合基序（A106-A360；A108-A362）、嘧啶結(jié)合基序（A397-A553；A399-A5

4、55）和轉(zhuǎn)酮醇酶C末端基序（A571- A676；A573-A678）等植物DXS蛋白典型的保守基序與功能位點。推導(dǎo) EuDXS1與EuDXS2蛋白二級結(jié)構(gòu)均以螺環(huán)結(jié)構(gòu)為主，分別占48.74%和49.37%。推導(dǎo)EuDXS1和EuDXS2蛋白三級結(jié)構(gòu)分別由兩個亞單位組成。EuDXS1蛋白與蓖麻DXS1蛋白親緣關(guān)系最為接近，EuDXS2蛋白與橡膠DXS2蛋白親緣關(guān)系最為接近。
　　1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸還原異構(gòu)酶DXR是ME

5、P途徑中的第二個限速酶，在杜仲中分離鑒定出兩個DXR酶基因家族成員，分別命名為EuDXR1和EuDXR2。EuDXR1基因cDNA全長1814 bp，5’端非編碼區(qū)長126 bp，3’端非編碼區(qū)長251 bp，編碼478個氨基酸，與毛果楊DXR基因序列的相似性最高，達(dá)81%；EuDXR2基因cDNA全長1779 bp，5’端非編碼區(qū)長163 bp，3’端非編碼區(qū)長251 bp，編碼472個氨基酸，與葡萄DXR基因序列的相似性最高，達(dá)81

6、%。推導(dǎo)EuDXR1與EuDXR2氨基酸序列中均包含轉(zhuǎn)運肽序列（A1-A51；A1-A43），具有2個DXR蛋白結(jié)合基序（A227-A236，A297-A307；A221-A230，A291- A301），2個NADPH結(jié)合基序（A88-A94，A113-A119；A82-A88，A107-A113）以及N端富脯氨酸基序（A61-A69；A55-A63）等植物 DXR蛋白典型的保守基序與功能位點。推導(dǎo)EuDXR1與EuDXR2蛋白二級結(jié)

7、構(gòu)均以螺環(huán)結(jié)構(gòu)為主，分別占47.91%和45.34%。推導(dǎo)EuDXR1和 EuDXR2蛋白三級結(jié)構(gòu)分別由兩個亞單位組成，在空間上呈“V”字結(jié)構(gòu)。EuDXR1蛋白與水稻DXR1蛋白親緣關(guān)系最為接近，EuDXR2蛋白與玉米DXR2蛋白親緣關(guān)系最為接近。
　　2-甲基-D-赤蘚醇-4-磷酸胞苷酰轉(zhuǎn)移酶MCT催化MEP途徑的第三步酶促反應(yīng)，在杜仲中分離出一個MCT酶基因，命名為EuMCT。EuMCT基因cDNA全長1435 bp，5’端非

8、編碼區(qū)長223 bp，3’端非編碼區(qū)長252 bp，編碼319個氨基酸，與葡萄MCT基因序列相似性最高，達(dá)82%。推導(dǎo) EuMCT氨基酸序列中包含轉(zhuǎn)運肽序列（A1-A75）以及植物MCT蛋白多個保守的功能位點（A100，A102，A103，A104，A105，A106，A114，A170，A171，A173，A176，A195，A196，A198，A228，A244，A250，A252，A300）。EuMCT蛋白二級結(jié)構(gòu)中α-螺旋占23

9、.82%，β-折疊占18.18%，螺環(huán)結(jié)構(gòu)占57.99%。EuMCT蛋白三級結(jié)構(gòu)由兩個亞單位組成，并且存在兩個特殊的P-loop結(jié)構(gòu)。EuMCT蛋白與葡萄MCT蛋白親緣關(guān)系最為接近。
　　4-（5’-焦磷酸胞苷）-2-C-甲基-D-赤蘚醇激酶CMK催化MEP途徑的羥基磷酸化反應(yīng)，在杜仲中分離出一個CMK酶基因，命名為EuCMK。EuCMK基因cDNA全長1644 bp，5’端非編碼區(qū)長256 bp，3’端非編碼區(qū)長203 bp，編

10、碼394個氨基酸，與番茄CMK基因序列相似性最高，達(dá)82%。EuCMK氨基酸序列中包含轉(zhuǎn)運肽序列（A1-A57）以及植物CMK蛋白催化過程中所必需的ATP結(jié)合位點（A186-A202）。推導(dǎo)EuCMK結(jié)構(gòu)α-螺旋占32.74%，β-折疊占19.29%，螺環(huán)結(jié)構(gòu)占47.97%。推導(dǎo)EuCMK蛋白三級結(jié)構(gòu)由兩個不對稱的亞基組成。EuCMK蛋白與葡萄CMK蛋白親緣關(guān)系最為接近。
　　2-甲基-D-赤蘚醇-2，4-環(huán)焦磷酸合酶MDS催化M

11、EP途徑的第五步酶促反應(yīng)，在杜仲中分離出一個MDS酶基因，命名為EuMDS。EuMDS基因cDNA全長976 bp，5’端非編碼區(qū)長119 bp，3’端非編碼區(qū)長146 bp，編碼236個氨基酸，與紫莖澤蘭MDS基因序列相似性最高，達(dá)79%。EuMDS氨基酸序列中包含轉(zhuǎn)運肽序列（A1-A56）以及多個植物MDS蛋白保守的功能位點（A84，A87，A89，A121，A213，A217，A221，A223，A228）。推導(dǎo)EuMDS蛋白二級

12、結(jié)構(gòu)中α-螺旋占40.25%，β-折疊占13.56%，螺環(huán)結(jié)構(gòu)占46.19%。推導(dǎo) EuMDS蛋白三級結(jié)構(gòu)由三個亞單位組成，并相互圍繞形成一個分子內(nèi)腔。EuMDS蛋白與啤酒花MDS蛋白親緣關(guān)系最為接近。
　　1-羥基-2-甲基-2-E-丁烯基-4-焦磷酸合酶HDS為MEP途徑的第六個作用酶，在杜仲中分離出一個HDS酶基因，命名為EuHDS。EuHDS基因cDNA全長2786 bp，5’端非編碼區(qū)長171 bp，3’端非編碼區(qū)長38

13、3 bp，編碼743個氨基酸，與葡萄HDS基因序列相似性最高，達(dá)84%。推導(dǎo) EuHDS氨基酸序列中包含轉(zhuǎn)運肽序列（A1-A30）、PSN基序（A58-A78）、PSI基序（A354-A620）以及植物HDS蛋白3個絕對保守的半胱氨酸位點（A644，A647，A678）。推導(dǎo)EuHDS蛋白二級結(jié)構(gòu)α-螺旋占37.55%，β-折疊占19.25%，螺環(huán)結(jié)構(gòu)占43.20%。推導(dǎo)EuHDS蛋白三級結(jié)構(gòu)N端為一個屬TIM-barrel超家族的八鏈

14、β桶形結(jié)構(gòu)，C端為一個兩側(cè)翼為螺旋結(jié)構(gòu)的β折疊構(gòu)造。EuHDS蛋白與葡萄HDS蛋白的親緣關(guān)系最為接近。
　　1-羥基-2-甲基-2-E-丁烯基-4-焦磷酸還原酶HDR是MEP途徑中的第三個關(guān)鍵酶，在杜仲中分離出一個HDR酶基因，命名為EuHDR。EuHDR基因cDNA全長1653 bp，5’端非編碼區(qū)長82 bp，3’端非編碼區(qū)長188 bp，編碼460個氨基酸，與喜樹HDR基因序列相似性最高，達(dá)82%。推導(dǎo) EuHDR氨基酸序列

15、中包含轉(zhuǎn)運肽序列（A1-A33）以及植物HDR蛋白多個保守的功能位點（A117，A208，A262，A345）。推導(dǎo)EuHDR蛋白二級結(jié)構(gòu)α-螺旋占35.65%，β-折疊占19.78%，螺環(huán)結(jié)構(gòu)占44.57%。推導(dǎo)EuHDR蛋白三級結(jié)構(gòu)為單體形式，呈不規(guī)則的三葉草形狀。EuHDR蛋白與葡萄HDR蛋白的親緣關(guān)系最為接近。
　　異戊烯基焦磷酸異構(gòu)酶IPI催化IPP與DMAPP之間的可逆轉(zhuǎn)化，是萜類代謝網(wǎng)絡(luò)的一個樞紐，在杜仲中分離出一個

16、IPI酶基因，命名為EuIPI。EuIPI基因cDNA全長1231 bp，5’端非編碼區(qū)長79 bp，3’端非編碼區(qū)長231 bp，編碼306個氨基酸，與喜樹IPI基因序列相似性最高，達(dá)84%。推導(dǎo)EuIPI氨基酸序列包含轉(zhuǎn)運肽序列（A1-A70）以及植物IPI蛋白典型的功能位點（A154、A175，A107、A119、A156、A196、A206、A208）。推導(dǎo)EuIPI蛋白二級結(jié)構(gòu)α-螺旋占22.55%，β-折疊占13.40%，螺