青蝦咽側體抑制激素(Allatostatin,AST)基因全長cDNA序列的克隆及表達分析.pdf

1、青蝦，學名日本沼蝦(Macrobrachium nipponense)，屬節(jié)肢動物門(Arthropoda)，甲殼綱(Crustacea)，十足目(Decapoda)，長臂蝦科(Palaemonidae)、沼蝦屬(Macrobrachium)，廣泛分布于全國各地。具有病害少、生長快、營養(yǎng)豐富等優(yōu)點，是我國淡水蝦蟹類的重要養(yǎng)殖品種。近年來隨著青蝦累代養(yǎng)殖規(guī)模逐漸擴大，出現(xiàn)了種質退化，規(guī)格小、性早熟等現(xiàn)象，嚴重影響了青蝦的養(yǎng)殖效益。因此，開

2、展青蝦蛻皮及生殖發(fā)育相關功能和機制的研究十分迫切。節(jié)肢動物門的昆蟲和甲殼動物都具有周期性蛻皮等相似的生理特性。首先在昆蟲中發(fā)現(xiàn)的咽側體抑制激素具有調節(jié)蛻皮和生殖的重要功能。甲殼動物腦神經(jīng)細胞分泌的甲殼動物咽側體抑制激素(Allatostatin，AST)神經(jīng)肽也具有促進蛻皮、性腺成熟、卵成熟以及調控生殖等重要功能。因此本文以青蝦腦組織為材料，對咽側體抑制激素(AST)基因全長cDNA序列進行了克隆，并檢測了AST基因在成體青蝦不同組織中

3、的表達，以期為青蝦AST基因相關功能的研究奠定基礎，同時也為青蝦蛻皮機制及生殖發(fā)育的研究提供參考。
　　 本研究在傳統(tǒng)基因克隆方法的基礎上采用分段克隆的方法克隆了青蝦AST基因的全長cDNA序列，即把青蝦AST基因全長cDNA序列分成幾個片段分別擴增。本實驗共擴增了4段中間片段cDNA，經(jīng)比對拼接后得到AST基因cDNA的全部中間序列，再與cDNA3'末端及5'末端拼接得出AST基因的全長cDNA序列。青蝦AST基因cDNA序列

4、全長2995bp，包括242bp的5'非編碼區(qū)(UTR)，647bp的3'UTR，2106bp的開放閱讀框(ORF)。在poly(A)上游具有明顯的加尾信號AATAAA，開放閱讀框共編碼701個氨基酸多肽前體，預測蛋白質分子量為78.7kDa，理論等電點為9.15。氨基酸多肽前體包括27個氨基酸組成的信號肽和674個氨基酸組成的成熟肽。成熟肽可加工成35個AST多肽，這些多肽在C末端都具有相同的Y/FXFGL-amide結構，屬于典型的

5、A型-AST，與昆蟲綱蜚蠊目昆蟲的AST多肽結構特征相同。將青蝦的AST多肽與克氏螯蝦(Procambarus clarkii)、三葉真蟹(Carcinus maenas)、斑節(jié)對蝦(Penaeus monodon)、大海蝦(Panulirus interruptus)、羅氏沼蝦(Macrobrachiumrosenbergii)的AST多肽比對，結果顯示保守氨基酸為Tyr、Phe、Gly、Leu幾種，保守的多肽為AST-19，26，2

6、9，青蝦特有的多肽為AST-3，8，16，20，24。部分昆蟲和甲殼動物AST蛋白相似度比對顯示，相似度均在60％以上，表明AST在無脊椎動物的進化中是相對保守的。系統(tǒng)進化樹分析表明，甲殼動物和昆蟲各自聚為一支，與傳統(tǒng)分類學分類結果相吻合，其中青蝦與羅氏沼蝦最先聚在一起，親緣關系最近。
　　 采用熒光定量PCR(qRT-PCR)技術分析了AST基因在青蝦腦、腸道、肝臟、心臟、精巢、卵巢6種組織中的表達情況。以β-actin基因為

7、內參基因。結果顯示，AST mRNA在6種組織中均有表達，表達水平依次為:肝臟＞腸道＞精巢＞腦＞心臟＞卵巢。已有的研究結果表明，AST多肽除了具有影響甲殼動物蛻皮和生殖的作用外，還能影響腸道和心臟的收縮頻率和幅度。本研究中，AST在肝臟中檢出量最高，與其他組織表達量均達到極顯著差異，其次在腸道和精巢中也具有較高的表達量，在腦和心臟中的表達量相對較低，在卵巢的表達量最低，組織間差異不顯著。
　　 本研究首次克隆得到了青蝦AST基因