油茶丙酮酸激酶基因的全長(zhǎng)cDNA及部分基因組序列克隆.pdf

1、油茶是我國(guó)南方重要的木本油料樹種,是世界四大木本油料樹種之一。在油茶種子生長(zhǎng)過程中,丙酮酸激酶(PK)基因作為糖酵解的關(guān)鍵酶,它控制生成的丙酮酸是脂肪酸合成的重要碳源,在光合產(chǎn)物轉(zhuǎn)化為脂肪酸的過程中起重要作用。因此研究油茶的 PK基因在揭示糖酵解對(duì)油脂合成的影響和油茶的分子育種具有重要意義。本論文主要研究結(jié)果如下:
　　 1.油茶PK基因的全長(zhǎng)cDNA克隆。在經(jīng)濟(jì)林育種與栽培國(guó)家林業(yè)局重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室已構(gòu)建的油茶cDNA文庫中,鑒定出

2、一條 PK基因片斷,長(zhǎng)度為約900bp,并且含有一個(gè) polyA尾巴。將此cDNA序列同其它物種的同類序列進(jìn)行比對(duì)發(fā)現(xiàn)相似性較高,并且此序列缺失5’端部分氨基酸殘基及非編碼區(qū)的cDNA序列。根據(jù)已知的PK基因EST序列,用專業(yè)軟件 Primer Premier’5.0設(shè)計(jì)了油茶PK基因的特異引物 GSP1、GSP2和GSP3。以油茶‘湘林1號(hào)’品種種子為材料提取 RNA,采用5'RACE技術(shù),擴(kuò)增出一條約1500bp的cDNA片斷。將該

3、片斷克隆到pMD18-T載體上,并轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α菌株中。經(jīng)過菌液PCR檢測(cè)、測(cè)序,得到該片斷的cDNA序列。通過Vector NTI9.0等生物信息學(xué)軟件的分析,將該序列與原來的EST序列進(jìn)行拼接,獲得了一條長(zhǎng)為2114bp的序列。根據(jù)拼接得到的序列,設(shè)計(jì)了兩對(duì)引物OEF1、OER1和OEF2、OER2,其中OEF1位于PK基因序列的5’端,OER2位于3’端,OER1與OEF2位于5'RACE片斷和 EST片斷的重迭區(qū),且相向

4、重迭13bp。采用交錯(cuò)延伸PCR技術(shù),用OEF1、OER1擴(kuò)增5'RACE片斷,OEF2、OER2擴(kuò)增.EST片斷,分別得到T1和T2,且它們有13bp的重迭部分。根據(jù)堿基互補(bǔ)原則,利用它們的重迭部分拼接成一個(gè)新的片斷,之后加入OEF1和OER2來擴(kuò)增拼接片斷,從而獲得了油茶PK基因的全長(zhǎng)cDNA。
　　 2.部分基因組序列克隆。以油茶‘湘林1號(hào)’品種葉片提取的基因組DNA為材料,以交錯(cuò)延伸引物OEF2和OER2為引物,獲得長(zhǎng)2

5、308bp的油茶PK基因部分基因組序列,通過NCBI網(wǎng)上比對(duì)確定其為油茶PK基因部分基因組序列。將油茶PK基因部分基因組序列與全長(zhǎng)cDNA比較,分析預(yù)測(cè)此序列含兩個(gè)外顯子長(zhǎng)度分別為476bp和220bp,一個(gè)內(nèi)含子長(zhǎng)度為1578bp。
　　 3.油茶PK基因的生物信息學(xué)分析。通過生物信息學(xué)軟件 Vector NTI9.0對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行分析:PK基因cDNA序列長(zhǎng)2114bp,含有一個(gè)1737bp的 ORF,編碼579個(gè)氨基酸殘基

6、；此外還含有長(zhǎng)108bp的5端非編碼區(qū),長(zhǎng)269bp的3端非編碼區(qū)及一個(gè)長(zhǎng)44bp的polyA尾巴。經(jīng)過在GenBank上的序列比對(duì)獲知此序列與其它物種的PK基因的相似性很高,由此確認(rèn)此序列是油茶的PK基因的全長(zhǎng)cDNA序列。根據(jù)PK基因的cDNA序列推導(dǎo)的蛋白質(zhì)序列,應(yīng)用一系列生物信息學(xué)軟件對(duì)理化性質(zhì)、高級(jí)結(jié)構(gòu)、三維模型等進(jìn)行預(yù)測(cè)分析,結(jié)果顯示此蛋白的等電點(diǎn) pI為5.105,分子量為63766.5Da,穩(wěn)定系數(shù)為52.95,屬于不穩(wěn)