IDH基因表達(dá)在成人急性髓細(xì)胞白血病中的臨床意義及機(jī)制研究.pdf

1、本文主要從以下幾部分進(jìn)行了論述。
　　第一部分 IDH基因表達(dá)在成人核型正常急性髓細(xì)胞白血病中的預(yù)后分析
　　目的:探討IDH基因mRNA表達(dá)與CN-AML患者預(yù)后的關(guān)系。
　　方法:采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)我院232例初發(fā)核型正常的急性髓細(xì)胞白血?。–N-AML）患者的骨髓單個(gè)核細(xì)胞、11例正常對(duì)照骨髓CD34+細(xì)胞和20例正常對(duì)照外周血單個(gè)核細(xì)胞中IDH1和IDH2基因mRNA表達(dá)水平;同時(shí)應(yīng)用PCR后直接測(cè)

2、序方法檢測(cè)CN-AML患者和正常對(duì)照的IDH1、IDH2、NMP1、FLT3-ITD、DNMT3A和CEBPA突變。比較IDH1和IDH2基因mRNA表達(dá)水平在CN-AML患者和正常對(duì)照之間的差異。分析IDH1和IDH2基因mRNA表達(dá)水平與CN-AML患者總體生存(OS)、無(wú)事件生存(EFS)和無(wú)復(fù)發(fā)生存（RFS）的關(guān)系;并分析IDH1和IDH2基因mRNA表達(dá)水平與其它臨床指標(biāo)和基因突變的關(guān)系。
　　結(jié)果:
　　1、與正

3、常對(duì)照相比，CN-AML患者IDH1基因mRNA表達(dá)水平高于正常對(duì)照骨髓CD34+細(xì)胞和正常對(duì)照外周血單個(gè)核細(xì)胞，p值分別為0.01和＜0.001;CN-AML患者IDH2基因mRNA表達(dá)水平高于正常對(duì)照外周血單個(gè)核細(xì)胞P＜0.001。
　　2、采用Kaplan-Meier分析，IDH1基因mRNA低表達(dá)組患者3年的OS和EFS分別為50％和31％，IDH1基因mRNA高表達(dá)組患者3年的OS和EFS分別為26％和16％，IDH1基

4、因mRNA低表達(dá)組的預(yù)后明顯優(yōu)于高表達(dá)組，其OS和EFS的P值均＜0.001。而IDH2基因mRNA表達(dá)與CN-AML患者預(yù)后沒(méi)有關(guān)系，0S、EFS和RFS差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，p值均＞0.05。
　　3、用Cox回歸模型糾正年齡、白細(xì)胞數(shù)、基因突變等因素，IDH1基因mRNA低表達(dá)組的預(yù)后明顯優(yōu)于高表達(dá)組，其OS和EFS的P值均＜0.001。IDH1基因mRNA高表達(dá)是CN-AML患者的預(yù)后因素，IDH1基因mRNA高表達(dá)者預(yù)后差

5、。
　　4、通過(guò)分析IDH1基因mRNA表達(dá)與臨床指標(biāo)和基因突變關(guān)系發(fā)現(xiàn):IDH1基因mRNA高表達(dá)主要集中M5患者中，其高表達(dá)與DNMT3A突變有關(guān)系，在DNMT3A突變患者中高表達(dá)者占16％，低表達(dá)者占5％，兩者差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P=0.007;IDH1基因mRNA高表達(dá)與CEBPA雙突變有關(guān)系，在CEBPA雙突變患者中高表達(dá)者占7％，低表達(dá)者占17％，兩者差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P=0.019。
　　結(jié)論:
　　我

6、們首次發(fā)現(xiàn)IDH1基因mRNA高表達(dá)是獨(dú)立于臨床指標(biāo)和高頻基因突變的預(yù)后不良的標(biāo)志物，IDH1基因mRNA表達(dá)水平可作為臨床預(yù)后危險(xiǎn)分層。
　　第二部分 IDH1基因表達(dá)在成人急性髓細(xì)胞白血病中的機(jī)制研究
　　目的:(1)探索IDH1基因在AML中的作用機(jī)制;(2)尋找調(diào)控IDH1基因mRNA表達(dá)的microRNA。
　　方法:
　　(1)采用siRNA干擾方法沉默THP-1和HL-60/ADR細(xì)胞的IDH1基因

7、，MTT法、流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)其對(duì)生長(zhǎng)、周期和凋亡影響，western blot檢測(cè)凋亡和信號(hào)通路蛋白變化。
　　(2)根據(jù)IDH1基因mRNA表達(dá)量高低從CN-AML中挑選16個(gè)患者標(biāo)本，IDH1基因mRNA高表達(dá)和低表達(dá)各8例，采用Agilent Microarray芯片(SBC HumanmiRNA Microarray Release16.0)進(jìn)行microRNA表達(dá)譜芯片分析，尋找與IDH1基因mRNA表達(dá)相關(guān)的microR

8、NA。熒光定量PCR檢測(cè)CN-AML患者的microRNA變化，對(duì)芯片結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證。
　　結(jié)果:
　　(1)沉默THP-1細(xì)胞IDH1基因后，小干擾組細(xì)胞生長(zhǎng)明顯低于陰性對(duì)照組（p=0.04）;小干擾組48小時(shí)凋亡率為37.22±8.27％，明顯高于陰性對(duì)照組19.50±1.18％(p=0.021)，并伴隨Caspase-3和PARP剪切帶增加，PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路抑制，但是小干擾組細(xì)胞與陰性對(duì)照組細(xì)胞相比，周

9、期變化差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p=0.89）。
　　(2)沉默THP-1細(xì)胞IDH1基因后給予臨床常用化療藥物如:HHT、ACR和DNR，能增加這些藥物對(duì)THP-1細(xì)胞的敏感性。
　　(3)沉默HL-60ADR細(xì)胞IDH1基因48小時(shí)后，Caspase-3和PARP剪切帶增加，PI3K/AKT信號(hào)通路抑制，能部分逆轉(zhuǎn)HL-60/ADR對(duì)阿霉素的耐藥。
　　(4)芯片結(jié)果顯示:IDH1基因mRNA高表達(dá)組的患者中miR-181

10、家族(miR-181a、miR-181a-2、miR-181b、miR-181c*、miR-181c、miR-181a*和miR-181d)、miR-146a、miR-128、miR-625、miR-25和miR-335低表達(dá)，miR-4286、miR-660、miR-107和miR-324-5p高表達(dá)，而在IDH1基因mRNA低表達(dá)組的患者中上述microRNAs表達(dá)相反。
　　(5)熒光定量PCR也證實(shí)了在IDH1基因mRNA

11、高表達(dá)組的患者miR-181d和miR-181b低表達(dá)，miR-4286高表達(dá);而在IDH1基因mRNA低表達(dá)組的患者中上述microRNA表達(dá)相反。
　　結(jié)論:
　　(1)下調(diào)IDH1基因表達(dá)能降低AML細(xì)胞株的增殖，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，增加化療藥物的敏感性和逆轉(zhuǎn)耐藥。
　　(2)在CN-AML患者中miR-181家族（miR-181d和miR-181b）起到抑癌基因作用，可能抑制IDH1基因mRNA的表達(dá)，miR-428