RelB基因沉默對骨髓樹突狀細胞生物免疫學功能的影響研究.pdf

1、目的： 樹突狀細胞(dendriticcell，DC)具有激活免疫應(yīng)答或誘導免疫耐受的功能，未成熟狀態(tài)的樹突狀細胞傾向于誘導免疫耐受產(chǎn)生，被稱為“致耐受DC(tolerogenicdendriticcell，TolDC)”。我們在成功建立體外擴增高純度小鼠骨髓樹突狀細胞(bonemarrow-deriveddendriticcell，BM-DC)方法的基礎(chǔ)上，利用最新的RNA干擾技術(shù)(RNAinterference，RNAi)針

2、對DC成熟的NFκB依賴途徑中關(guān)鍵基因—RelB基因，篩選出最佳的siRNAPCR表達框序列，用于構(gòu)建RelB基因沉默的RNAiRelBDC，并從細胞形態(tài)、細胞表面分子表達、細胞免疫功能等方面對RNAiRelBDC的生物免疫學特性進行了比較研究，以期構(gòu)建出RelB基因沉默的全新致耐受DC--RNAiRelBDC，驗證其誘導T細胞免疫耐受特性及可能機制，為其成功用于治療移植排斥反應(yīng)及自身免疫性疾病提供可靠的理論和實驗依據(jù)。 方法：

3、 1、骨髓DC的體外培養(yǎng)與鑒定研究： 分離C57BL/6小鼠骨髓前體細胞，在重組小鼠粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(rmGM-CSF)和重組白細胞介素4(rmIL-4)刺激下，手法篩選并結(jié)合CD11c+免疫磁珠分選方法，培養(yǎng)擴增骨髓來源DC(BM-DC)，并通過細菌脂多糖(LPS)刺激誘導DC成熟。 2、樹突狀細胞RelB基因沉默及效果檢測研究： 根據(jù)siRNA設(shè)計原則預先設(shè)計3段RelBsiRNA序列，采

4、用美國綠陽公司PCR表達框試劑盒，構(gòu)建出相應(yīng)的3種RelBsiRNA表達框(R1/siRNA、R2/siRNA、R3/siRNA)，轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)的未成熟DC。實驗分為六組：①Control-DC組；②LPS-DC組；③R1/siRNA轉(zhuǎn)染組：用R1/siRNA轉(zhuǎn)染未成熟DC；④R2/siRNA轉(zhuǎn)染組：用R2/siRNA轉(zhuǎn)染未成熟DC；⑤R3/siRNA轉(zhuǎn)染組：用R3/siRNA轉(zhuǎn)染未成熟DC；⑥GFP/siRNA轉(zhuǎn)染組：用GFP/siR

5、NA轉(zhuǎn)染未成熟DC，也即本實驗的陰性對照組)。采用RT-PCR和細胞免疫熒光方法分別在mRNA水平和蛋白質(zhì)水平檢測比較各組DC的RelB基因表達情況，篩選出RelB基因沉默效果最好的有效siRNA序列。 3、RelB基因沉默對樹突狀細胞的生物免疫學功能影響研究： 在成功構(gòu)建RNAiRelBDC基礎(chǔ)上，實驗分成四組：①Control-DC組；②LPS-DC組；③RelB基因沉默組(RNAiRelB-DC)：第4天經(jīng)過Rel

6、BsiRNA處理的培養(yǎng)第6天的DC；④LPS刺激的RelB基因沉默組(LPS-RNAiRelB-DC)：第4天經(jīng)過RelBsiRNA處理和結(jié)束前加入外源性LPS(1μg/ml)刺激24h的培養(yǎng)第6天收集的DC。 結(jié)果： 1、在rmGM-CSF和rmIL-4誘導下，可從小鼠骨髓培養(yǎng)擴增出大量DC，每兩只小鼠獲得BM-DC約1～2×107個，完全滿足實驗需要。單純手法篩選，BM-DC中CD11c陽性率達70％以上，若結(jié)合CD

7、11c+免疫磁性細胞分選方法，可將陽性率提高至90％以上。 2、Control-DC組細胞形態(tài)多為圓形，皺褶多，突起較少，細胞器也少，但胞內(nèi)較多吞飲泡，細胞表型檢測MHCⅡ類分子低水平表達，共刺激分子低表達(CD40、CD86等)，細胞分泌IL-12水平較低，MLR表明該類DC刺激同種異基因T細胞增殖能力較弱，表現(xiàn)出未成熟DC的特點。 3、PCR表達框方法可以得到設(shè)計好的針對RelB基因3個不同位點的RelBsiRNA，

8、可用于骨髓未成熟DC的轉(zhuǎn)染實驗。RT-PCR顯示，與另外兩個位點相比，R2/siRNA可以明顯抑制細胞RelB基因表達(P＜0.001)；細胞免疫熒光分析結(jié)果也顯示R2/siRNA可以明顯減弱RelB蛋白表達水平。 4、RNAiRelBDC形態(tài)為圓形或橢圓性，胞內(nèi)有大量囊泡結(jié)構(gòu)，部分囊泡可見吞噬的異物，細胞核多偏向一側(cè)，溶酶體和線粒體等細胞器少，表面突起少，形態(tài)較規(guī)則；細胞表達MHC-Ⅱ類分子、CD40、CD86等表面分子較低。

9、 5、RNAiRelBDC刺激T細胞增殖能力較Control-DC還弱，其中當T/DC比例為10：1和5：1時，兩組間差異有顯著性(P值分別為0.037和0.003)；LPS刺激后RNAiRelBDC刺激T細胞增殖能力未見明顯增高，與LPS-DC組DC的MLR能力差異仍有顯著性(P＜0.001)。 6、RNAiRelBDC分泌IL-12的能力顯著低于LPS-DC，二者差異有顯著性(P＜0.001)，而與Control-D

10、CIL-12的表達水平接近。LPS-RNAiRelB-DC的表達IL-12的水平略高于RNAiRelBDC組，但與LPS-DC組也存在顯著性差異(P＜0.001)。 7、RNAiRelBDC與Control-DC和LPS-DC相比，顯著抑制T細胞分泌IL-2(P值均＜0.001)和IFN-γ(P值分別為P＜0.001和P=0.016)。四組細胞分泌IL-4、IL-10未見明顯差異，RNAiRelBDC顯示較強的分泌IL-4、IL

11、-10的能力。 8、RNAiRelBDC和LPS-RNAiRelBDC誘導CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細胞生成比例與LPS-DC相比顯著增加(P值均小于0.001)，RNAiRelBDC誘導調(diào)節(jié)性T細胞生成能力較Control-DC強，差異具有顯著性(P=0.028)。 結(jié)論： 1、小鼠骨髓前體細胞在rmGM-CSF和rmIL-4誘導下，可擴增到大量的DC。 2、手法篩選結(jié)合CD11c陽性細胞免疫磁珠分選方

12、法可以得到90％以上純度的DC，適合應(yīng)用于DC的分子免疫學研究。 3、R2/siRNAPCR表達框轉(zhuǎn)染DC可以在mRNA和蛋白質(zhì)水平明顯抑制細胞RelB基因表達，不影響細胞活力和形態(tài)，是最佳的候選siRNA靶位點，適合用于構(gòu)建RNAiRelBDC。 4、RNAiRelBDC為圓形或橢圓性，胞內(nèi)有大量囊泡結(jié)構(gòu)，表面突起少，與未成熟DC形態(tài)結(jié)構(gòu)相似。 5、RNAiRelBDC細胞表達MHC-Ⅱ類分子、CD40、CD8

13、6等表面分子相對較低，MLR顯示較弱的刺激T細胞增殖能力。 6、RNAiRelBDC低水平分泌IL-12，MLR反應(yīng)中誘導Th0向Th2細胞偏倚，IL-2和IFN-γ分泌抑制，IL-10和IL-4分泌相對占優(yōu)勢，同時誘導CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細胞大量生成。 7、RNAiRelBDC在細胞形態(tài)、細胞表面分子表達、細胞免疫學功能等方面與未成熟DC相似，具有致耐受DC特性，有望用于治療移植排斥反應(yīng)及自身免疫性疾病的防治。

14、 主要創(chuàng)新點： 1、建立簡便、相對經(jīng)濟的體外大規(guī)模擴增高純度骨髓樹突狀細胞培養(yǎng)方法。改良Inaba建立的經(jīng)典樹突狀細胞體外擴增方法，采用培養(yǎng)第2天手法篩選結(jié)合培養(yǎng)第6天CD11c免疫磁珠分選方法，成功建立穩(wěn)定、簡便、相對經(jīng)濟的大量擴增高純度骨髓來源DC的培養(yǎng)方法，每兩只小鼠骨髓可擴增得到1～2×107個DC，CD11c陽性率達到90％以上，具有典型的DC形態(tài)和功能特點，完全適合DC功能的分子生物學研究需要。 2、首

15、次采用RNA干擾技術(shù)特異性沉默DC成熟關(guān)鍵基因RelB基因的表達。本研究采用siRNAPCR表達框方法，在預選設(shè)計的3個siRNA靶位點(1027、302和1121，分別表示為R1/siRNA、R2/siRNA和R3/siRNA)中，通過轉(zhuǎn)染后DCRelB基因在mRNA和蛋白表達水平的比較研究，首次成功獲得R2/siRNA為有效的RelB基因特異性沉默位點。目前國內(nèi)外未見類似報道。 3、首次構(gòu)建出RelB基因沉默DC(RNAiR

16、elBDC)，并從細胞形態(tài)、細胞表面分子表達、細胞免疫學功能等方面研究了RNAiRelBDC的生物免疫學功能特性，初步證實RNAiRelBDC由于RelB基因被有效沉默，表現(xiàn)為未成熟DC的形態(tài)和功能特點，不能被LPS刺激其成熟，是一種全新的致耐受DC，有望應(yīng)用于移植免疫耐受誘導和自身免疫性疾病生物治療。目前國內(nèi)外未見類似報道。 4、首次描述RNAiRelBDC生物學和免疫學功能特點為：細胞形態(tài)為圓形或橢圓形，胞內(nèi)大量囊泡結(jié)構(gòu)，細

17、胞器較少，細胞表面突起少，與未成熟DC具有相似的形態(tài)結(jié)構(gòu)。細胞表面低表達MHC-Ⅱ、CD40、CD86等分子，混合淋巴細胞反應(yīng)(MLR)中顯示較弱的刺激異基因T細胞增殖的能力，細胞分泌IL-12水平較低，MLR反應(yīng)中誘導Th0向Th2細胞偏倚，Th1細胞因子(IL-2和IFN-γ)分泌抑制，Th2細胞因子(IL-10和IL-4)分泌相對占優(yōu)勢，同時誘導CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細胞大量生成。RNAiRelBDC生物免疫學特性的闡明對RN