青藤堿對RA患者樹突狀細(xì)胞免疫功能的影響及機(jī)制研究.pdf

1、背景 類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)是最為常見的以關(guān)節(jié)炎癥表現(xiàn)為主的自身免疫性疾病。在全世界，RA的發(fā)病率平均為1％，男女比例為1:3，RA可發(fā)生于任何年齡階段，發(fā)病的高峰為40-60歲。雖然，RA的發(fā)病遍布世界各個(gè)地區(qū)，但工業(yè)化國家的發(fā)病率一般比其他國家至少高3倍。RA的臨床表現(xiàn)較為廣泛，持續(xù)性和進(jìn)展性的外周關(guān)節(jié)滑膜炎癥、血管翳形成以及由此導(dǎo)致的骨和軟骨的損傷是RA發(fā)病的主要特點(diǎn)。 RA

2、的發(fā)病機(jī)制目前仍然沒有闡明，目前認(rèn)為RA是一種多因素聯(lián)合介導(dǎo)的自身免疫性疾病。在RA的發(fā)病過程中，滑膜組織的慢性炎癥引起RA患者關(guān)節(jié)滑膜成纖維細(xì)胞增生、血管過度形成，T細(xì)胞、B細(xì)胞、漿細(xì)胞以及巨噬細(xì)胞在RA關(guān)節(jié)滑膜中浸潤。RA的發(fā)病以及疾病活動(dòng)性都與HLA-DR4或HLA-DRl相關(guān)，這證明了T細(xì)胞在RA的發(fā)病中具有舉足輕重的作用。RA可以被看作是未知抗原誘導(dǎo)T細(xì)胞活化介導(dǎo)的自身免疫病。MHC分子給CD4+T細(xì)胞提呈自身抗原是T細(xì)胞活化

3、的第一步。在抗原的刺激下，炎癥細(xì)胞分泌、合成炎癥因子，引起滑膜炎癥。樹突狀細(xì)胞(dendritic cells，DC)是功能最為強(qiáng)大的專職抗原提呈細(xì)胞，能夠激活初始免疫反應(yīng)。DC在免疫監(jiān)視的淋巴組織中捕獲、處理抗原，而后在移行至外周淋巴組織的過程中逐漸分化成熟。成熟的DC可將抗原肽提呈給T細(xì)胞，并促使Th細(xì)胞向Th1型或Th2型細(xì)胞分化，同時(shí)DC可表達(dá)協(xié)同刺激分子誘導(dǎo)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞和B細(xì)胞免疫反應(yīng)，分泌細(xì)胞因子產(chǎn)生相應(yīng)的生物學(xué)效應(yīng)。成熟的

4、．DC可活化淋巴細(xì)胞誘導(dǎo)免疫反應(yīng)，而不成熟的DC則可誘導(dǎo)T細(xì)胞的對自身抗原的免疫耐受，減少自身免疫的發(fā)生。因此，DC在RA的發(fā)病中起著重要的作用。RA屬于祖國傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)“痹病”范疇?！氨圆　笔且蛉梭w遭受風(fēng)、寒、濕、熱之邪的侵襲，氣血為病邪陰閉而引起的疾病。以筋骨、肌肉、關(guān)節(jié)酸痛、麻木、重著、屈伸不利和關(guān)節(jié)腫大、灼熱等為臨床主要表現(xiàn)。按病因的不同可分為行痹、寒痹、濕痹、熱痹、風(fēng)濕熱痹等。臨床上具有漸進(jìn)性或反復(fù)發(fā)作的特點(diǎn)。其主要病機(jī)是氣血痹阻

5、不通，筋脈關(guān)節(jié)失于濡養(yǎng)。因此，“痹病”以祛風(fēng)、除濕、舒筋活絡(luò)為治療大法，并隨其寒熱而兼行清熱或祛寒。清風(fēng)藤用于治療關(guān)節(jié)炎已經(jīng)有兩千多年的歷史。青藤堿是清風(fēng)藤的單體提取物，現(xiàn)代藥理研究顯示，青藤堿具有良好的抗炎和抗風(fēng)濕的作用。雖然青藤堿的很多藥理學(xué)活性，如抗炎、鎮(zhèn)痛、免疫抑制、抗心律不齊等，已經(jīng)逐漸被人們認(rèn)識，但青藤堿的免疫抑制和抗風(fēng)濕的機(jī)理尚未完全闡明。本研究觀察了青藤堿對RA患者外周血DC免疫功能的影響，同時(shí)深入探討了青藤堿對DC影響

6、的機(jī)制，進(jìn)一步闡明了青藤堿的免疫抑制和抗風(fēng)濕機(jī)理。 目的： 1．建立人外周血DC體外培養(yǎng)體系； 2．觀察青藤堿對RA患者外周血DC免疫功能的影響； 3．建立Toll樣受體(toll like receptor，TLR)2 mRNA和TLR4 mRNA熒光定量PCR檢測體系； 4．觀察青藤堿對RA患者外周血DC中TLR2、TLR4mRNA和蛋白表達(dá)的影響； 5．觀察青藤堿對RA患者外周血DC

7、中核因子-κB(nuclear factor-kappa B，NF-κB)活性和核易位的影響； 6．進(jìn)一步揭示青藤堿免疫抑制的機(jī)理，進(jìn)一步為青藤堿治療RA提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 方法： 1．人外周血DC體外培養(yǎng)體系的建立分離人外周血單核細(xì)胞，RPMI-1640完全培養(yǎng)基培養(yǎng)，采用GM-CSF和IL-4聯(lián)合刺激，于培養(yǎng)第8天收獲，即control DC。在培養(yǎng)結(jié)束前12h加入脂多糖(lipopolysacchar。i

8、de，LPS)(1μg/ml)刺激成熟，即LPS-DC。光學(xué)顯微鏡、電子顯微鏡觀察DC形態(tài)。分離、培養(yǎng)同種異體T淋巴細(xì)胞，采用同種異體混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)(mixed lymphocyte reaction，MLR)檢測DC對T細(xì)胞的刺激作用。直接免疫熒光標(biāo)記細(xì)胞，流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞表型。 2．青藤堿對RA患者外周血DC免疫功能的影響將16名活動(dòng)期RA患者隨機(jī)分為青藤堿高、中、低劑量組和空白對照組，體外培養(yǎng)、誘導(dǎo)RA患者DC。于培養(yǎng)

9、結(jié)束前12h在培養(yǎng)基中分別按照低、中、高濃度加入青藤堿溶液至終濃度為1mmol/L、2mmol/L、5mmol/L，空白對照組加入等量溶解介質(zhì)。MTT法檢測青藤堿在0.1mM，2mM，5mM，10mM，15mM，20mM濃度下對DC的細(xì)胞毒性作用。收集青藤堿干預(yù)后的RA患者外周血DC，流式細(xì)胞儀檢測，DC表型，MLR檢測DC對同種異體T細(xì)胞的刺激作用。收集DC培養(yǎng)上清，ELISA方法檢測培養(yǎng)上清中IL-12p70含量。提取RA患者外周血

10、DC總RNA，采用半定量R-T-PCR檢測CD80 mRNA、CD86 mRNA、IL-12p35mRNA的表達(dá)。 3．青藤堿對RA患者外周血DC中TLR2和TLR4表達(dá)的影響青藤堿干預(yù)RA患者外周血DC，收集干預(yù)后的細(xì)胞提取DC總RNA并逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。PCR擴(kuò)增TLR2、TLR4、GAPDHcDNA片段，回收并純化：PCR．產(chǎn)物。將TLR2、TLR4、GAPDH的PCR產(chǎn)物分別按10<'8>，10<'7>，10<'6>，1

11、0<'5>，10<'4>copies/μl梯度倍比稀釋，熒光定量PCR儀檢測并自動(dòng)計(jì)算出樣品的定量結(jié)果，描繪標(biāo)準(zhǔn)曲線。將各樣本cDNA按照建立體系中的反應(yīng)條件在熒光定量PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增，由電腦自動(dòng)分析并計(jì)算出反應(yīng)體系中待測樣品cDNA達(dá)到設(shè)定閾值的循環(huán)數(shù)(Ct值)。以公式2<'-ΔΔt>計(jì)算出相對于空白對照組的青藤堿干預(yù)各組的DC中TLR2 mRNA、TLR4 mRNA的表達(dá)水平。提取RA患者外周血DC總蛋白，SDS-PAGE電泳分析

12、后采用western-blotting檢測TLR2、TLR4蛋白的表達(dá)。 4．青藤堿對RA患者外周血DC中NF-κB活性和核易位的影響收集青藤堿干預(yù)后的RA患者外周血DC，提取DC總RNA和蛋白。半定量 RT-PCR檢測DC中RelB mRNA的表達(dá)，western-blotting檢測青藤堿對RA患者DC中磷酸化p38MAPK和IKBα表達(dá)的影響。提取DC核蛋白，凝膠遲滯實(shí)驗(yàn) 檢測RA患者外周血DC中NF-κB的活性。FITC

13、標(biāo)記DC內(nèi)RelB蛋白，激光共聚焦掃描顯微鏡下觀察DC中RelB核易位的情況。 5．統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS10.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，結(jié)果以X±S表示，兩種處理因素設(shè)計(jì)的均數(shù)比較采用析因設(shè)計(jì)的方差分析，并進(jìn)一步分析處理的單獨(dú)效應(yīng)、主效應(yīng)和交互作用；單因素設(shè)計(jì)的多組間均數(shù)比較采用 One way-ANOVA，多個(gè)組分別與對照組比較采用Dunnett檢驗(yàn)；兩組間均數(shù)比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，P<0.05為顯著性差異。 結(jié)果

14、： 1．在GM-CSF和IL-4聯(lián)合刺激的作用下，單核細(xì)胞成功的分化為DC。在光鏡和電鏡下觀察可見其呈現(xiàn)典型的樹突狀形態(tài)，流式細(xì)胞儀檢測其表達(dá)CDla、CD40、CD80、CD83、CD86、HLA-DR，并且隨著DC數(shù)目的增多其對T細(xì)胞刺激能力逐漸增強(qiáng)。 2．經(jīng)lmM，2raM，5mM，lOmM青藤堿溶液干預(yù)后的DC其細(xì)胞活力與對照組無顯著性改變(P>0.05)，經(jīng)15mM，20mM青藤堿溶液干預(yù)后的DC其細(xì)胞活力與空

15、白對照組相比有顯著性降低(P<0.01)。 3．經(jīng)陽性梯度定量模板數(shù)與Ct值關(guān)系對數(shù)擬合作圖，得到不同梯度定量模板的對數(shù)值與循環(huán)數(shù)(Ct值)之間關(guān)系的標(biāo)準(zhǔn)曲線，分別有著非常好的相關(guān)關(guān)系(r值分別為0.9985，0.9945，0.9912)。 4．PCR擴(kuò)增結(jié)果顯示，青藤堿4個(gè)劑量組之間RA患者外周血DC中RelBmRNA表達(dá)無顯著性差異，Western-blot檢測結(jié)果顯示，經(jīng)青藤堿干預(yù)后4組磷酸化p38和IKBα的表

16、達(dá)均有所改變，但p-IκBα的改變有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。 結(jié)論： 1．以外周血單核細(xì)胞為前體，以GM-CSF和IL-4兩種細(xì)胞因子為刺激，可充分誘導(dǎo)出具有免疫功能和特征形態(tài)、表型的人外周血DC。 2．青藤堿可能通過抑制RA患者DC的免疫功能而阻斷RA患者自身反應(yīng)性T細(xì)胞的活化，控制其介導(dǎo)的炎癥損傷，最后達(dá)到緩解和治療RA的作用。 3．青藤堿可能至少從以下幾個(gè)方面抑制了RA患者DC的成熟或成熟DC的功能，從而抑制了

17、RA患者自身反應(yīng)性T細(xì)胞的異?；罨?1)青藤堿可抑制DC表達(dá)MHC Ⅱ類分子，阻斷或減弱了DC對自身反應(yīng)性T細(xì)胞的提呈自身抗原的能力，抑制了自身反應(yīng)性T細(xì)胞的增殖；(2)青藤堿可抑制DC協(xié)同刺激分子的蛋白和基因的表達(dá)，阻斷或減弱了DC為自身反應(yīng)性T細(xì)胞提供的協(xié)同刺激信號，抑制了自身反應(yīng)性T細(xì)胞的活化；(3)青藤堿可抑制DC合成和分泌IL-12，阻斷了DC對活化后的自身反應(yīng)性T細(xì)胞的誘導(dǎo)和分化能力，抑制了自身反應(yīng)性T細(xì)胞的分化。4．青藤